Dziękujemy za odwiedzenie strony Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Ustanowienie zwierzęcych modeli zmian modycznych (MC) stanowi ważną podstawę do badania MC. Pięćdziesiąt cztery białe króliki nowozelandzkie podzielono na grupę operacji pozorowanej, grupę implantacji mięśnia (grupa ME) i grupę implantacji jądra miażdżystego (grupa NPE). W grupie NPE krążek międzykręgowy odsłonięto za pomocą przednio-bocznego dostępu chirurgicznego w odcinku lędźwiowym, a do nakłucia trzonu kręgu L5 w pobliżu płytki granicznej użyto igły. NP został wyekstrahowany z krążka międzykręgowego L1/2 za pomocą strzykawki i wstrzyknięty do niego. Wiercenie otworu w kości podchrzęstnej. Procedury chirurgiczne i metody wiercenia w grupie implantacji mięśnia i grupie operacji pozorowanej były takie same jak w grupie implantacji NP. W grupie ME do otworu wprowadzono kawałek mięśnia, podczas gdy w grupie operacji pozorowanej nic nie wprowadzono do otworu. Po operacji wykonano skanowanie MRI i badania biologii molekularnej. Sygnał w grupie NPE uległ zmianie, ale nie zaobserwowano wyraźnej zmiany sygnału w grupie operacji pozorowanej ani w grupie ME. Obserwacja histologiczna wykazała nieprawidłową proliferację tkanki w miejscu implantacji, a ekspresja IL-4, IL-17 i IFN-γ była zwiększona w grupie NPE. Implantacja NP do kości podchrzęstnej może stanowić zwierzęcy model MC.
Zmiany typu Modic (MC) to zmiany w płytkach granicznych kręgów i przyległym szpiku kostnym widoczne w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Są one dość powszechne u osób z objawami towarzyszącymi1. Wiele badań podkreśla znaczenie MC ze względu na jego związek z bólem krzyża (LBP)2,3. de Roos i wsp.4 oraz Modic i wsp.5 niezależnie jako pierwsi opisali trzy różne typy nieprawidłowości sygnału podchrzęstnego w szpiku kostnym kręgów. Zmiany typu Modic I są hipointensywne w sekwencjach T1-zależnych (T1W) i hiperintensywne w sekwencjach T2-zależnych (T2W). Ta zmiana uwidacznia płytki graniczne szczelin i przyległą tkankę ziarninową naczyniową w szpiku kostnym. Zmiany typu Modic II wykazują wysoki sygnał zarówno w sekwencjach T1-, jak i T2-zależnych. W tego typu zmianach można zaobserwować zniszczenie płytki granicznej, a także histologiczną substytucję tłuszczową przyległego szpiku kostnego. Zmiany typu Modic III wykazują niski sygnał w sekwencjach T1- i T2-zależnych. Zaobserwowano zmiany sklerotyczne odpowiadające płytkom granicznym6. MC jest uważane za chorobę patologiczną kręgosłupa i jest ściśle związane z wieloma chorobami zwyrodnieniowymi kręgosłupa7,8,9.
Biorąc pod uwagę dostępne dane, kilka badań dostarczyło szczegółowych informacji na temat etiologii i mechanizmów patologicznych MC. Albert i wsp. zasugerowali, że MC może być spowodowane przepukliną krążka międzykręgowego8. Hu i wsp. przypisali MC poważnemu zwyrodnieniu krążka międzykręgowego10. Kroc zaproponował koncepcję „wewnętrznego pęknięcia krążka międzykręgowego”, która zakłada, że powtarzające się urazy krążka międzykręgowego mogą prowadzić do mikropęknięć w płytce granicznej. Po powstaniu rozszczepu, zniszczenie płytki granicznej przez jądro miażdżyste (NP) może wywołać odpowiedź autoimmunologiczną, która z kolei prowadzi do rozwoju MC11. Ma i wsp. podzielili podobny pogląd i donieśli, że autoimmunizacja indukowana przez NP odgrywa kluczową rolę w patogenezie MC12.
Komórki układu odpornościowego, a zwłaszcza limfocyty T pomocnicze CD4+, odgrywają kluczową rolę w patogenezie chorób autoimmunologicznych13. Niedawno odkryty podtyp Th17 produkuje prozapalną cytokinę IL-17, promuje ekspresję chemokin i stymuluje limfocyty T w uszkodzonych narządach do produkcji IFN-γ14. Limfocyty Th2 również odgrywają unikalną rolę w patogenezie odpowiedzi immunologicznej. Ekspresja IL-4 jako reprezentatywna komórka Th2 może prowadzić do poważnych konsekwencji immunopatologicznych15.
Chociaż przeprowadzono wiele badań klinicznych nad MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, nadal brakuje odpowiednich zwierzęcych modeli eksperymentalnych, które mogłyby naśladować proces MC, często występujący u ludzi, i mogłyby zostać wykorzystane do badania etiologii lub nowych metod leczenia, takich jak terapia celowana. Do tej pory opisano tylko kilka zwierzęcych modeli MC, które badałyby leżące u jego podstaw mechanizmy patologiczne.
Opierając się na teorii autoimmunologicznej zaproponowanej przez Alberta i Ma, w niniejszym badaniu stworzono prosty i powtarzalny model MC u królika poprzez autotransplantację NP w pobliżu wywierconej płytki granicznej kręgu. Kolejnym celem jest obserwacja charakterystyki histologicznej modeli zwierzęcych i ocena specyficznych mechanizmów NP w rozwoju MC. W tym celu wykorzystujemy techniki takie jak biologia molekularna, MRI i badania histologiczne, aby zbadać progresję MC.
Dwa króliki padły z powodu krwawienia podczas operacji, a cztery w trakcie znieczulenia podczas rezonansu magnetycznego. Pozostałe 48 królików przeżyło i nie wykazywało żadnych objawów behawioralnych ani neurologicznych po operacji.
Rezonans magnetyczny (MRI) pokazuje, że intensywność sygnału tkanki osadzonej w różnych otworach jest różna. Intensywność sygnału trzonu kręgu L5 w grupie NPE stopniowo zmieniała się po 12, 16 i 20 tygodniach od wszczepienia (sekwencja T1W wykazała niski sygnał, a sekwencja T2W sygnał mieszany z niskim sygnałem) (ryc. 1C), podczas gdy obrazowanie MRI pozostałych dwóch grup osadzonej tkanki pozostało względnie stabilne w tym samym okresie (ryc. 1A, B).
(A) Reprezentatywne sekwencyjne MRI kręgosłupa lędźwiowego królika w 3 punktach czasowych. Nie stwierdzono nieprawidłowości sygnału w obrazach grupy operacji pozorowanej. (B) Charakterystyka sygnału trzonu kręgu w grupie ME jest podobna do charakterystyki w grupie operacji pozorowanej i nie zaobserwowano istotnych zmian sygnału w miejscu wszczepienia w czasie. (C) W grupie NPE niski sygnał jest wyraźnie widoczny w sekwencji T1W, a sygnał mieszany i niski są wyraźnie widoczne w sekwencji T2W. Od 12. do 20. tygodnia sporadycznie występujące wysokie sygnały otaczające niskie sygnały w sekwencji T2W zmniejszają się.
Widoczna hiperplazja kości widoczna jest w miejscu implantacji trzonu kręgu w grupie NPE, a hiperplazja kości występuje szybciej, od 12 do 20 tygodni (ryc. 2C) w porównaniu z grupą NPE; nie zaobserwowano żadnych istotnych zmian w modelowanych trzonach kręgów; grupa pozorowana i grupa ME (ryc. 2C) 2A,B).
(A) Powierzchnia trzonu kręgu w miejscu implantacji jest bardzo gładka, otwór goi się dobrze, a w trzonie kręgu nie występuje hiperplazja. (B) Kształt miejsca implantacji w grupie ME jest podobny do kształtu w grupie operacji pozorowanej i nie obserwuje się wyraźnych zmian w wyglądzie miejsca implantacji z upływem czasu. (C) W grupie NPE w miejscu implantacji wystąpiła hiperplazja kości. Hiperplazja kości szybko się nasilała i objęła nawet krążek międzykręgowy, sięgając do przeciwległego trzonu kręgu.
Analiza histologiczna dostarcza bardziej szczegółowych informacji na temat tworzenia kości. Rycina 3 przedstawia zdjęcia skrawków pooperacyjnych barwionych hematoksyliną i eozyną. W grupie operacji pozorowanej chondrocyty były dobrze ułożone i nie zaobserwowano proliferacji komórek (ryc. 3A). Sytuacja w grupie ME była podobna do tej w grupie operacji pozorowanej (ryc. 3B). Natomiast w grupie NPE zaobserwowano dużą liczbę chondrocytów i proliferację komórek NP w miejscu implantacji (ryc. 3C);
(A) W pobliżu płytki końcowej widoczne są beleczki kostne, chondrocyty są uporządkowane, komórki są jednakowej wielkości i kształtu, bez proliferacji (40 razy). (B) Stan miejsca implantacji w grupie ME jest podobny do stanu w grupie pozorowanej. Widoczne są beleczki kostne i chondrocyty, ale nie ma wyraźnej proliferacji w miejscu implantacji (40 razy). (B) Widoczna jest znaczna proliferacja chondrocytów i komórek NP, a kształt i wielkość chondrocytów są nierównomierne (40 razy).
Ekspresję mRNA interleukiny 4 (IL-4), mRNA interleukiny 17 (IL-17) i mRNA interferonu γ (IFN-γ) obserwowano zarówno w grupie NPE, jak i ME. Porównując poziomy ekspresji genów docelowych, stwierdzono istotny wzrost ekspresji genów IL-4, IL-17 i IFN-γ w grupie NPE w porównaniu z grupą ME i grupą operacji pozorowanej (ryc. 4) (P < 0,05). W porównaniu z grupą operacji pozorowanej, poziomy ekspresji IL-4, IL-17 i IFN-γ w grupie ME wzrosły jedynie nieznacznie i nie osiągnęły wartości statystycznych (P > 0,05).
Ekspresja mRNA IL-4, IL-17 i IFN-γ w grupie NPE wykazywała istotnie wyższą tendencję niż w grupie operacji pozorowanej i grupie ME (P < 0,05).
Natomiast w grupie ME poziomy ekspresji nie wykazały znaczącej różnicy (P>0,05).
W celu potwierdzenia zmienionego wzorca ekspresji mRNA wykonano analizę Western blot z użyciem komercyjnie dostępnych przeciwciał przeciwko IL-4 i IL-17. Jak pokazano na rysunkach 5A i B, w porównaniu z grupą ME i grupą operacji pozorowanej, poziomy białek IL-4 i IL-17 w grupie NPE były istotnie podwyższone (P < 0,05). W porównaniu z grupą operacji pozorowanej, poziomy białek IL-4 i IL-17 w grupie ME również nie osiągnęły statystycznie istotnych zmian (P > 0,05).
(A) Poziomy białka IL-4 i IL-17 w grupie NPE były istotnie wyższe niż w grupie ME i grupie placebo (P < 0,05). (B) Histogram Western blot.
Ze względu na ograniczoną liczbę próbek ludzkich pobranych podczas operacji, jednoznaczne i szczegółowe badania patogenezy MC są nieco utrudnione. Podjęliśmy próbę stworzenia zwierzęcego modelu MC w celu zbadania jego potencjalnych mechanizmów patologicznych. Jednocześnie, do śledzenia przebiegu MC wywołanego autoprzeszczepem NP, wykorzystano ocenę radiologiczną, histologiczną i biologię molekularną. W rezultacie, model implantacji NP spowodował stopniową zmianę intensywności sygnału od 12 do 20 tygodnia (mieszany niski sygnał w sekwencjach T1W i niski sygnał w sekwencjach T2W), co wskazuje na zmiany w tkance, a ocena histologiczna i biologia molekularna potwierdziły wyniki badania radiologicznego.
Wyniki tego eksperymentu pokazują, że w grupie NPE wystąpiły zmiany wizualne i histologiczne w miejscu naruszenia trzonu kręgu. Jednocześnie zaobserwowano ekspresję genów IL-4, IL-17 i IFN-γ, a także IL-4, IL-17 i IFN-γ, co wskazuje, że naruszenie autologicznej tkanki jądra miażdżystego w trzonie kręgu może powodować szereg zmian sygnałowych i morfologicznych. Łatwo zauważyć, że charakterystyka sygnału trzonów kręgów modelu zwierzęcego (niski sygnał w sekwencji T1W, sygnał mieszany i niski sygnał w sekwencji T2W) jest bardzo podobna do charakterystyki komórek kręgów ludzkich, a charakterystyka MRI potwierdza również obserwacje histologiczne i anatomii makroskopowej, tj. zmiany w komórkach trzonu kręgu są postępujące. Chociaż reakcja zapalna wywołana ostrym urazem może pojawić się wkrótce po nakłuciu, wyniki MRI wykazały, że stopniowo narastające zmiany sygnału pojawiły się 12 tygodni po nakłuciu i utrzymywały się do 20 tygodni bez oznak powrotu do normy lub cofnięcia zmian MRI. Wyniki te sugerują, że autologiczna neurotransmisja kręgów jest wiarygodną metodą ustalania postępującej mikrorefluksowej niewydolności serca u królików.
Ten model nakłucia wymaga odpowiednich umiejętności, czasu i wysiłku chirurgicznego. We wstępnych eksperymentach, preparowanie lub nadmierna stymulacja struktur więzadłowych przykręgosłupowych może skutkować tworzeniem się osteofitów kręgowych. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić ani nie podrażnić sąsiednich dysków. Ponieważ głębokość penetracji musi być kontrolowana, aby uzyskać spójne i powtarzalne wyniki, ręcznie wykonaliśmy korek, odcinając osłonkę igły o długości 3 mm. Użycie tego korka zapewnia równomierną głębokość wiercenia w trzonie kręgu. We wstępnych eksperymentach trzech chirurgów ortopedycznych biorących udział w operacji stwierdziło, że igły o rozmiarze 16 G są łatwiejsze w użyciu niż igły o rozmiarze 18 G lub inne metody. Aby uniknąć nadmiernego krwawienia podczas wiercenia, przytrzymanie igły nieruchomo przez chwilę zapewni bardziej odpowiedni otwór, co sugeruje, że w ten sposób można kontrolować pewien stopień MC.
Chociaż wiele badań koncentrowało się na MC, niewiele wiadomo na temat etiologii i patogenezy MC25,26,27. Na podstawie naszych wcześniejszych badań stwierdziliśmy, że autoimmunizacja odgrywa kluczową rolę w występowaniu i rozwoju MC12. W niniejszym badaniu zbadaliśmy ilościową ekspresję IL-4, IL-17 i IFN-γ, które są głównymi szlakami różnicowania komórek CD4+ po stymulacji antygenem. W naszym badaniu, w porównaniu z grupą ujemną, grupa NPE charakteryzowała się wyższą ekspresją IL-4, IL-17 i IFN-γ, a także wyższym poziomem białek IL-4 i IL-17.
Klinicznie, ekspresja mRNA IL-17 jest zwiększona w komórkach NP u pacjentów z przepukliną krążka międzykręgowego28. Zwiększone poziomy ekspresji IL-4 i IFN-γ stwierdzono również w modelu ostrej nieuciskającej przepukliny krążka międzykręgowego w porównaniu ze zdrowymi osobami kontrolnymi29. IL-17 odgrywa kluczową rolę w zapaleniu, uszkodzeniu tkanek w chorobach autoimmunologicznych30 i wzmacnia odpowiedź immunologiczną na IFN-γ31. Zwiększone uszkodzenie tkanek pośredniczone przez IL-17 odnotowano u myszy MRL/lpr32 i myszy podatnych na autoimmunizację33. IL-4 może hamować ekspresję cytokin prozapalnych (takich jak IL-1β i TNFα) i aktywację makrofagów34. Doniesiono, że ekspresja mRNA IL-4 była inna w grupie NPE w porównaniu z IL-17 i IFN-γ w tym samym punkcie czasowym; Ekspresja mRNA IFN-γ w grupie NPE była istotnie wyższa niż w pozostałych grupach. Zatem produkcja IFN-γ może być mediatorem odpowiedzi zapalnej indukowanej przez interkalację NP. Badania wykazały, że IFN-γ jest wytwarzany przez wiele typów komórek, w tym aktywowane limfocyty T pomocnicze typu 1, komórki NK i makrofagi35,36, i jest kluczową cytokiną prozapalną, która promuje odpowiedzi immunologiczne37.
Niniejsze badanie sugeruje, że odpowiedź autoimmunologiczna może być zaangażowana w występowanie i rozwój MC. Luoma i wsp. stwierdzili, że charakterystyka sygnału MC i widocznego NP jest podobna w MRI i oba wykazują wysoki sygnał w sekwencji T2W38. Potwierdzono, że niektóre cytokiny, takie jak IL-139, są ściśle związane z występowaniem MC. Ma i wsp. zasugerowali, że uwypuklenie NP ku górze lub w dół może mieć duży wpływ na występowanie i rozwój MC12. Bobechko40 i Herzbein i wsp.41 donieśli, że NP jest tkanką immunotolerancyjną, która nie może dostać się do krążenia naczyniowego od urodzenia. Uwypuklenie NP wprowadza ciała obce do krwiobiegu, pośrednicząc w ten sposób w lokalnych reakcjach autoimmunologicznych42. Reakcje autoimmunologiczne mogą indukować wiele czynników immunologicznych, a gdy czynniki te są stale eksponowane na tkanki, mogą powodować zmiany w sygnalizacji43. W niniejszym badaniu nadmierna ekspresja IL-4, IL-17 i IFN-γ to typowe czynniki immunologiczne, co dodatkowo potwierdza ścisły związek między NP a MCs44. Ten model zwierzęcy dobrze naśladuje przebicie NP i wniknięcie do płytki końcowej. Proces ten dodatkowo ujawnił wpływ autoimmunizacji na MC.
Zgodnie z oczekiwaniami, ten model zwierzęcy zapewnia nam potencjalną platformę do badania MC. Jednak model ten nadal ma pewne ograniczenia: po pierwsze, w fazie obserwacji zwierząt, niektóre króliki w stadium pośrednim muszą zostać uśmiercone w celu przeprowadzenia badań histologicznych i biologii molekularnej, przez co niektóre zwierzęta z czasem „wypadają z użytku”. Po drugie, chociaż w tym badaniu ustalono trzy punkty czasowe, niestety modelowaliśmy tylko jeden typ MC (zmianę Modic typu I), więc nie jest to wystarczające do odzwierciedlenia procesu rozwoju choroby u ludzi i konieczne jest ustalenie większej liczby punktów czasowych, aby lepiej obserwować wszystkie zmiany sygnału. Po trzecie, zmiany w strukturze tkanki można rzeczywiście wyraźnie uwidocznić za pomocą barwienia histologicznego, ale niektóre specjalistyczne techniki pozwalają lepiej ujawnić zmiany mikrostrukturalne w tym modelu. Na przykład, mikroskopia w świetle spolaryzowanym została wykorzystana do analizy tworzenia się chrząstki włóknistej w krążkach międzykręgowych królika45. Długoterminowy wpływ NP na MC i płytkę graniczną wymaga dalszych badań.
Pięćdziesiąt cztery białe króliki nowozelandzkie płci męskiej (waga około 2,5-3 kg, wiek 3-3,5 miesiąca) podzielono losowo na grupę operacji pozorowanej, grupę implantacji mięśni (grupa ME) oraz grupę implantacji korzeni nerwowych (grupa NPE). Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala w Tianjinie, a metody eksperymentalne przeprowadzono ściśle zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
Wprowadzono pewne ulepszenia do techniki chirurgicznej S. Sobajima 46 . Każdego królika umieszczono w pozycji leżącej na boku, a przednią powierzchnię pięciu kolejnych krążków międzykręgowych odcinka lędźwiowego kręgosłupa (IVD) odsłonięto za pomocą tylno-bocznego dostępu zaotrzewnowego. Każdemu królikowi podano znieczulenie ogólne (20% uretan, 5 ml/kg przez żyłę słuchową). Wykonano podłużne nacięcie skóry od dolnej krawędzi żeber do krawędzi miednicy, 2 cm brzusznie od mięśni przykręgosłupowych. Prawy przednio-boczny kolec od L1 do L6 odsłonięto przez ostre i tępe rozwarstwienie tkanki podskórnej, tkanki zaotrzewnowej i mięśni (ryc. 6A). Poziom krążka określono, wykorzystując krawędź miednicy jako anatomiczny punkt orientacyjny dla poziomu krążka L5-L6. Za pomocą igły punkcyjnej o rozmiarze 16 wywiercić otwór w pobliżu płytki granicznej kręgu L5 na głębokość 3 mm (ryc. 6B). Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml odessać autologiczne jądro miażdżyste z krążka międzykręgowego L1-L2 (ryc. 6C). Usunąć jądro miażdżyste lub mięsień, w zależności od potrzeb każdej grupy. Po pogłębieniu otworu, na powięź głęboką, powięź powierzchowną i skórę zakłada się szwy wchłanialne, uważając, aby nie uszkodzić tkanki okostnej trzonu kręgu podczas zabiegu.
(A) Odsłonięcie dysku L5–L6 odbywa się za pomocą tylno-bocznego dostępu zaotrzewnowego. (B) Za pomocą igły o grubości 16 wywiercić otwór w pobliżu płytki granicznej L5. (C) Pobrać autologiczne komórki macierzyste.
Znieczulenie ogólne podano 20% roztworem uretanu (5 ml/kg) do żyły usznej, a zdjęcia rentgenowskie kręgosłupa lędźwiowego powtórzono po 12, 16 i 20 tygodniach po operacji.
Króliki uśmiercono poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (25,0 mg/kg) i dożylne podanie pentobarbitalu sodu (1,2 g/kg) w 12., 16. i 20. tygodniu po operacji. Cały kręgosłup usunięto do analizy histologicznej, a następnie wykonano analizę rzeczywistą. Do wykrycia zmian w czynnikach odpornościowych zastosowano ilościową odwrotną transkrypcję (RT-qPCR) i Western blotting.
Badania MRI przeprowadzono u królików przy użyciu klinicznego magnesu 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) wyposażonego w ortogonalny odbiornik cewki kończynowej. Króliki znieczulono 20% uretanem (5 ml/kg) przez żyłę słuchową, a następnie umieszczono je w pozycji leżącej w magnesie, z odcinkiem lędźwiowym wyśrodkowanym na okrągłej cewce powierzchniowej o średnicy 5 cali (GE Medical Systems). Uzyskano czołowe obrazy lokalizatora T2-ważone (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) w celu określenia położenia krążka międzykręgowego w odcinku lędźwiowym kręgosłupa od L3–L4 do L5–L6. Uzyskano warstwy T2-ważone w płaszczyźnie strzałkowej przy następujących ustawieniach: szybka sekwencja echa spinowego z czasem powtarzania (TR) 2200 ms i czasem echa (TE) 70 ms, matryca; pole widzenia 260 i osiem bodźców; grubość cięcia wynosiła 2 mm, przerwa 0,2 mm.
Po wykonaniu ostatniego zdjęcia i uśmierceniu ostatniego królika, krążki pozorowane, zatopione w mięśniach i krążki z NP usunięto do badania histologicznego. Tkanki utrwalono w 10% obojętnej, buforowanej formalinie przez 1 tydzień, odwapniono kwasem etylenodiaminotetraoctowym i pocięto na skrawki parafinowe. Bloki tkankowe zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki strzałkowe (o grubości 5 μm) za pomocą mikrotomu. Skrawki barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E).
Po pobraniu krążków międzykręgowych od królików z każdej grupy, przeprowadzono ekstrakcję całkowitego RNA za pomocą kolumny UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Chiny) zgodnie z instrukcją producenta i systemem odwrotnej transkrypcji ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, USA). Przeprowadzono odwrotną transkrypcję.
RT-qPCR przeprowadzono z użyciem aparatu Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) i SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Objętość reakcji PCR wynosiła 20 μl i zawierała 1,5 μl rozcieńczonego cDNA oraz 0,2 μM każdego startera. Startery zaprojektowała firma OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA), a wyprodukowała firma Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Chiny) (Tabela 1). Zastosowano następujące warunki cykli termicznych: początkowa aktywacja polimerazy w temperaturze 94°C przez 2 minuty, następnie 40 cykli po 15 sekund każdy w temperaturze 94°C w celu denaturacji matrycy, hybrydyzacja przez 1 minutę w temperaturze 60°C, wydłużenie i fluorescencja. Pomiary wykonywano przez 1 minutę w temperaturze 72°C. Wszystkie próbki amplifikowano trzykrotnie, a średnią wartość wykorzystano do analizy RT-qPCR. Dane amplifikacji analizowano za pomocą FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia, USA). Ekspresję genów IL-4, IL-17 i IFN-γ znormalizowano do poziomu kontroli endogennej (ACTB). Względne poziomy ekspresji docelowego mRNA obliczono metodą 2-ΔΔCT.
Całkowite białko ekstrahowano z tkanek przy użyciu homogenizatora tkankowego w buforze lizy RIPA (zawierającym koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy), a następnie wirowano z prędkością 13 000 obr./min przez 20 min w temperaturze 4°C w celu usunięcia resztek tkanki. Pięćdziesiąt mikrogramów białka załadowano na ścieżkę, rozdzielono 10% żelem SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membranę PVDF. Blokowanie przeprowadzono w 5% odtłuszczonym mleku w proszku w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris (TBS) zawierającym 0,1% Tween 20 przez 1 h w temperaturze pokojowej. Membranę inkubowano z króliczym przeciwciałem pierwotnym anty-dekoryny (rozcieńczonym 1:200; Boster, Wuhan, Chiny) (rozcieńczonym 1:200; Bioss, Pekin, Chiny) przez noc w temperaturze 4°C i poddano reakcji drugiego dnia; z przeciwciałem wtórnym (kozia anty-królicza immunoglobulina G w rozcieńczeniu 1:40 000) w połączeniu z peroksydazą chrzanową (Boster, Wuhan, Chiny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnały Western blot wykryto poprzez zwiększoną chemiluminescencję na membranie chemiluminescencyjnej po napromieniowaniu rentgenowskim. Do analizy densytometrycznej bloty zeskanowano i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania BandScan, a wyniki wyrażono jako stosunek immunoreaktywności genu docelowego do immunoreaktywności tubuliny.
Obliczenia statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania SPSS16.0 (SPSS, USA). Dane zebrane w trakcie badania wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe (średnia ± SD) i przeanalizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA) w celu określenia różnic między obiema grupami. Za wartość statystycznie istotną uznano p < 0,05.
Zatem stworzenie zwierzęcego modelu MC poprzez wszczepienie autologicznych nanocząstek do trzonu kręgu i przeprowadzenie makroanatomicznej obserwacji, analizy MRI, oceny histologicznej i analizy biologii molekularnej może stać się ważnym narzędziem oceny i zrozumienia mechanizmów ludzkiej MC oraz opracowania nowych interwencji terapeutycznych.
Jak cytować ten artykuł: Han, C. i in. Model zwierzęcy zmian Modica uzyskano poprzez wszczepienie autologicznego jądra miażdżystego do kości podchrzęstnej odcinka lędźwiowego kręgosłupa. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. i Boos, N. Rezonans magnetyczny kręgosłupa lędźwiowego: częstość występowania przepukliny i zatrzymania krążka międzykręgowego, ucisku korzeni nerwowych, nieprawidłowości płytki końcowej i choroby zwyrodnieniowej stawów międzykręgowych u bezobjawowych ochotników. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS i Leboeuf-Eed, K. Zmiany Modica i ich związek z wynikami badań klinicznych. European Spine Journal: oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Kręgosłupa, Europejskiego Towarzystwa Deformacji Kręgosłupa i Europejskiego Towarzystwa Badań nad Kręgosłupem Szyjnym 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. i wsp. Zmiany typu Modic w płytkach granicznych kręgów lędźwiowych: częstość występowania i związek z bólem dolnej części pleców i rwą kulszową u mężczyzn w średnim wieku. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. i Dalinka, M. Rezonans magnetyczny zmian w szpiku kostnym w pobliżu płytki końcowej w chorobie zwyrodnieniowej kręgosłupa lędźwiowego. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ i Carter, JR. Choroba zwyrodnieniowa krążka międzykręgowego: ocena zmian w szpiku kostnym za pomocą MRI. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS i Carter, JR. Obrazowanie choroby zwyrodnieniowej krążka międzykręgowego. Radiologia 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS i wsp. Czynniki predykcyjne zmian sygnału płytki granicznej kręgów szyjnych (Modic) w populacji ogólnej. European Spine Journal: Oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Kręgosłupa, Europejskiego Towarzystwa Deformacji Kręgosłupa i Europejskiego Towarzystwa Badań nad Kręgosłupem Szyjnym, Oddział 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB i Mannisch, K. Zmiany Modica po przepuklinie krążka międzykręgowego w odcinku lędźwiowym kręgosłupa. European Spine Journal: oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Kręgosłupa, Europejskiego Towarzystwa Deformacji Kręgosłupa i Europejskiego Towarzystwa Badań nad Kręgosłupem Szyjnym 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. i Kaapa, E. Zmiany typu Modica I mogą być predyktorem szybko postępującej deformacji krążka międzykręgowego: roczne badanie prospektywne. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ i Fan, SW Zmiany Modica: możliwe przyczyny i udział w zwyrodnieniu krążka międzykręgowego w odcinku lędźwiowym kręgosłupa. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Wewnętrzne pęknięcie dysku. Problemy z wypadaniem dysku u osób w wieku 50 lat. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Czas publikacji: 13 grudnia 2024 r.