Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zalecamy użycie nowszej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłość wsparcia, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Ustanowienie zwierzęcych modeli zmian modycznych (MC) jest ważną podstawą badania MC. Pięćdziesiąt cztery króliki nowozelandzkie rasy białej podzielono na grupę po pozorowanej operacji, grupę po wszczepieniu mięśni (grupa ME) i grupę po wszczepieniu jądra miażdżystego (grupa NPE). W grupie NPE krążek międzykręgowy odsłonięto z dostępu przednio-bocznego w odcinku lędźwiowym, a trzon kręgu L5 w pobliżu płytki końcowej nakłuto igłą. NP pobrano strzykawką z krążka międzykręgowego L1/2 i wstrzyknięto do niego. Wiercenie otworu w kości podchrzęstnej. Procedury chirurgiczne i metody wiercenia w grupie implantacji mięśni i grupie operacji pozorowanej były takie same jak w grupie implantacji NP. W grupie ME do otworu włożono kawałek mięśnia, natomiast w grupie, w której wykonano operację pozorowaną, do otworu nie włożono niczego. Po operacji wykonano badanie MRI oraz badania z zakresu biologii molekularnej. Sygnał w grupie NPE uległ zmianie, ale nie było oczywistej zmiany sygnału w grupie operacji pozorowanej i grupie ME. Obserwacja histologiczna wykazała, że w grupie NPE zaobserwowano nieprawidłową proliferację tkanki w miejscu implantacji, a także zwiększoną ekspresję IL-4, IL-17 i IFN-γ. Wszczepienie NP do kości podchrzęstnej może stworzyć zwierzęcy model MC.
Zmiany modyczne (MC) to zmiany w obrębie płytek końcowych kręgów i sąsiadującego szpiku kostnego widoczne w badaniu rezonansu magnetycznego (MRI). Występują dość często u osób z towarzyszącymi objawami1. Wiele badań podkreślało znaczenie MC ze względu na jego związek z bólem krzyża (LBP)2,3. de Roos i wsp.4 oraz Modic i wsp.5 niezależnie jako pierwsi opisali trzy różne typy nieprawidłowości sygnału podchrzęstnego w szpiku kostnym kręgu. Modyczne zmiany typu I są hipointensywne w sekwencjach T1-zależnych (T1W) i hiperintensywne w sekwencjach T2-zależnych (T2W). Zmiana ta ujawnia płytki końcowe szczelin i przylegającą tkankę ziarninową naczyń w szpiku kostnym. Zmiany typu Modic II wykazują wysoki sygnał zarówno w sekwencjach T1W, jak i T2W. W tego typu zmianach stwierdza się zniszczenie płytki końcowej oraz histologiczną wymianę tłuszczową sąsiadującego szpiku kostnego. Zmiany typu Modic III pokazują niski sygnał w sekwencjach T1W i T2W. Zaobserwowano zmiany sklerotyczne odpowiadające płytkom końcowym6. MC jest uważana za chorobę patologiczną kręgosłupa i jest ściśle powiązana z wieloma chorobami zwyrodnieniowymi kręgosłupa7,8,9.
Biorąc pod uwagę dostępne dane, kilka badań dostarczyło szczegółowych informacji na temat etiologii i patologicznych mechanizmów MC. Alberta i in. zasugerowali, że MC może być spowodowane przepukliną dysku8. Hu i in. przypisano MC poważnemu zwyrodnieniu dysku10. Kroc zaproponował koncepcję „wewnętrznego pęknięcia krążka”, która stwierdza, że powtarzające się urazy krążka mogą prowadzić do mikrouszkodzeń w płytce końcowej. Po utworzeniu rozszczepu zniszczenie płytki końcowej przez jądro miażdżyste (NP) może wywołać odpowiedź autoimmunologiczną, co dalej prowadzi do rozwoju MC11. Ma i in. podzielili podobny pogląd i donieśli, że autoimmunizacja indukowana NP odgrywa kluczową rolę w patogenezie MC12.
Komórki układu odpornościowego, zwłaszcza limfocyty T pomocnicze CD4+, odgrywają kluczową rolę w patogenezie chorób autoimmunologicznych13. Niedawno odkryta podgrupa Th17 wytwarza prozapalną cytokinę IL-17, sprzyja ekspresji chemokin i stymuluje limfocyty T w uszkodzonych narządach do wytwarzania IFN-γ14. Komórki Th2 odgrywają również wyjątkową rolę w patogenezie odpowiedzi immunologicznych. Ekspresja IL-4 jako reprezentatywnej komórki Th2 może prowadzić do poważnych konsekwencji immunopatologicznych15.
Chociaż przeprowadzono wiele badań klinicznych na MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, nadal brakuje odpowiednich modeli eksperymentalnych na zwierzętach, które mogłyby naśladować proces MC, który często występuje u ludzi i może być wykorzystywane do badania etiologii lub nowych metod leczenia, takich jak terapia celowana. Do chwili obecnej zgłoszono, że tylko kilka modeli zwierzęcych MC badało leżące u ich podstaw mechanizmy patologiczne.
W oparciu o teorię autoimmunologiczną zaproponowaną przez Alberta i Ma, w badaniu tym ustalono prosty i powtarzalny model MC królika poprzez autoprzeszczepienie NP w pobliżu nawierconej płytki końcowej kręgów. Inne cele to obserwacja cech histologicznych modeli zwierzęcych i ocena specyficznych mechanizmów NP w rozwoju MC. W tym celu stosujemy techniki takie jak biologia molekularna, MRI i badania histologiczne w celu zbadania postępu MC.
Dwa króliki zmarły z powodu krwawienia podczas operacji, a cztery króliki zmarły podczas znieczulenia podczas rezonansu magnetycznego. Pozostałe 48 królików przeżyło i po operacji nie wykazywało żadnych objawów behawioralnych ani neurologicznych.
MRI pokazuje, że intensywność sygnału tkanki osadzonej w różnych otworach jest różna. Intensywność sygnału trzonu kręgu L5 w grupie NPE stopniowo zmieniała się po 12, 16 i 20 tygodniach od założenia (sekwencja T1W wykazywała niski sygnał, a sekwencja T2W wykazywała sygnał mieszany i niski) (ryc. 1C), podczas gdy obraz MRI pozostałych dwóch grup osadzonych części pozostawało w tym samym okresie stosunkowo stabilne (ryc. 1A, B).
(A) Reprezentatywne sekwencyjne MRI kręgosłupa lędźwiowego królika w 3 punktach czasowych. Na obrazach grupy pozorowanej operacji nie stwierdzono żadnych nieprawidłowości. (B) Charakterystyka sygnału trzonu kręgu w grupie ME jest podobna do charakterystyki w grupie operacji pozorowanej i nie obserwuje się znaczących zmian sygnału w miejscu osadzania w czasie. (C) W grupie NPE niski sygnał jest wyraźnie widoczny w sekwencji T1W, a sygnał mieszany i niski sygnał są wyraźnie widoczne w sekwencji T2W. Od okresu 12 tygodni do okresu 20 tygodni sporadyczne wysokie sygnały otaczające niskie sygnały w sekwencji T2W maleją.
W grupie NPE widoczny jest wyraźny przerost kości w miejscu implantacji trzonu kręgu, a przerost kości następuje szybciej od 12 do 20 tygodni (ryc. 2C) w porównaniu z grupą NPE, nie obserwuje się istotnych zmian w modelowanym kręgu ciała; Grupa pozorowana i grupa ME (ryc. 2C) 2A,B).
(A) Powierzchnia trzonu kręgu w miejscu wszczepienia jest bardzo gładka, otwór dobrze się goi, a w trzonie kręgu nie występuje przerost. (B) Kształt miejsca wszczepienia w grupie ME jest podobny do kształtu w grupie operacji pozorowanej i nie ma widocznych zmian w wyglądzie miejsca wszczepienia w czasie. (C) W grupie NPE wystąpił przerost kości w miejscu wszczepienia. Rozrost kości gwałtownie wzrastał i rozciągał się nawet przez krążek międzykręgowy do trzonu kręgu po stronie przeciwnej.
Analiza histologiczna dostarcza bardziej szczegółowych informacji na temat tworzenia kości. Rycina 3 przedstawia fotografie skrawków pooperacyjnych barwionych H&E. W grupie pozorowanej operacji chondrocyty były dobrze ułożone i nie wykryto proliferacji komórek (ryc. 3A). Sytuacja w grupie ME była podobna jak w grupie operacji pozorowanej (ryc. 3B). Natomiast w grupie NPE zaobserwowano dużą liczbę chondrocytów i proliferację komórek NP-podobnych w miejscu implantacji (ryc. 3C);
(A) Beleczki można zobaczyć w pobliżu płytki końcowej, chondrocyty są starannie ułożone, mają jednakową wielkość i kształt komórek oraz brak proliferacji (40 razy). (B) Stan miejsca implantacji w grupie ME jest podobny do stanu w grupie pozorowanej. Widoczne są beleczki i chondrocyty, ale nie widać wyraźnej proliferacji w miejscu implantacji (40 razy). (B) Można zauważyć, że chondrocyty i komórki NP-podobne proliferują znacząco, a kształt i wielkość chondrocytów są nierówne (40 razy).
Ekspresję mRNA interleukiny 4 (IL-4), mRNA interleukiny 17 (IL-17) i mRNA interferonu γ (IFN-γ) obserwowano zarówno w grupach NPE, jak i ME. Kiedy porównano poziomy ekspresji genów docelowych, ekspresja genów IL-4, IL-17 i IFN-γ była znacząco zwiększona w grupie NPE w porównaniu z grupą ME i grupą pozorowanej operacji (ryc. 4). (P < 0,05). W porównaniu z grupą pozorowaną operację, poziomy ekspresji IL-4, IL-17 i IFN-γ w grupie ME wzrosły tylko nieznacznie i nie osiągnęły zmiany statystycznej (P > 0,05).
Ekspresja mRNA IL-4, IL-17 i IFN-γ w grupie NPE wykazywała znacząco wyższą tendencję niż w grupie pozorowanej operacji i grupie ME (P < 0,05).
Natomiast poziomy ekspresji w grupie ME nie wykazały istotnej różnicy (P>0,05).
Analizę Western blot przeprowadzono przy użyciu dostępnych w handlu przeciwciał przeciwko IL-4 i IL-17, aby potwierdzić zmieniony wzór ekspresji mRNA. Jak pokazano na Rycinach 5A, B, w porównaniu z grupą ME i grupą pozorowaną operacją, poziomy białek IL-4 i IL-17 w grupie NPE były znacząco zwiększone (P <0,05). W porównaniu z grupą pozorowaną, poziomy białek IL-4 i IL-17 w grupie ME również nie osiągnęły statystycznie istotnych zmian (P> 0,05).
(A) Poziomy białek IL-4 i IL-17 w grupie NPE były znacząco wyższe niż w grupie ME i grupie placebo (P <0,05). (B) Histogram Western blot.
Ze względu na ograniczoną liczbę próbek ludzkich uzyskanych podczas operacji jasne i szczegółowe badania patogenezy MC są dość trudne. Próbowaliśmy ustalić zwierzęcy model MC, aby zbadać jego potencjalne mechanizmy patologiczne. Jednocześnie wykorzystano ocenę radiologiczną, ocenę histologiczną i ocenę biologii molekularnej do śledzenia przebiegu MC wywołanego autoprzeszczepem NP. W rezultacie model implantacji NP spowodował stopniową zmianę intensywności sygnału z punktów czasowych od 12 do 20 tygodni (mieszany niski sygnał w sekwencjach T1W i niski sygnał w sekwencjach T2W), wskazując na zmiany w tkankach oraz histologiczne i molekularne oceny biologiczne potwierdziły wyniki badania radiologicznego.
Wyniki tego doświadczenia pokazują, że w grupie NPE wystąpiły zmiany wizualne i histologiczne w miejscu naruszenia trzonu kręgowego. Jednocześnie zaobserwowano ekspresję genów IL-4, IL-17 i IFN-γ, a także IL-4, IL-17 i IFN-γ, co wskazuje, że naruszenie autologicznej tkanki jądra miażdżystego w kręgosłupie organizmie może powodować szereg zmian sygnałowych i morfologicznych. Łatwo stwierdzić, że charakterystyka sygnału trzonów kręgów modelu zwierzęcego (niski sygnał w sekwencji T1W, sygnał mieszany i niski sygnał w sekwencji T2W) jest bardzo podobna do charakterystyk ludzkich komórek kręgowych, a charakterystyka MRI również potwierdzają obserwacje histologiczne i anatomiczne, czyli zmiany w komórkach trzonu kręgowego mają charakter postępujący. Chociaż odpowiedź zapalna spowodowana ostrym urazem może pojawić się wkrótce po nakłuciu, wyniki MRI wykazały, że stopniowo narastające zmiany sygnału pojawiły się 12 tygodni po nakłuciu i utrzymywały się do 20 tygodni bez żadnych oznak ustąpienia lub odwrócenia zmian w MRI. Wyniki te sugerują, że autologiczne NP kręgowe jest wiarygodną metodą ustalania postępującego MV u królików.
Ten model nakłucia wymaga odpowiednich umiejętności, czasu i wysiłku chirurgicznego. We wstępnych eksperymentach rozwarstwienie lub nadmierna stymulacja struktur więzadeł przykręgowych może skutkować powstaniem osteofitów kręgowych. Należy uważać, aby nie uszkodzić ani nie podrażnić sąsiednich krążków. Ponieważ w celu uzyskania spójnych i powtarzalnych wyników należy kontrolować głębokość penetracji, zatyczkę wykonaliśmy ręcznie, odcinając osłonkę igły o długości 3 mm. Stosowanie tego korka zapewnia równomierną głębokość wiercenia w trzonie kręgu. We wstępnych eksperymentach trzech chirurgów ortopedów biorących udział w operacji stwierdziło, że igły o rozmiarze 16 są łatwiejsze w użyciu niż igły o rozmiarze 18 lub innymi metodami. Aby uniknąć nadmiernego krwawienia podczas wiercenia, trzymanie igły nieruchomo przez chwilę zapewni bardziej odpowiedni otwór do wprowadzenia, co sugeruje, że w ten sposób można kontrolować pewien stopień MC.
Chociaż wiele badań dotyczyło MC, niewiele wiadomo na temat etiologii i patogenezy MC25,26,27. Na podstawie naszych poprzednich badań odkryliśmy, że autoimmunizacja odgrywa kluczową rolę w występowaniu i rozwoju MC12. W badaniu tym zbadano ilościową ekspresję IL-4, IL-17 i IFN-γ, które są głównymi szlakami różnicowania komórek CD4+ po stymulacji antygenem. W naszym badaniu, w porównaniu z grupą negatywną, grupa NPE miała wyższą ekspresję IL-4, IL-17 i IFN-γ, a poziomy białek IL-4 i IL-17 były również wyższe.
Klinicznie ekspresja mRNA IL-17 jest zwiększona w komórkach NP pacjentów z przepukliną dysku28. Zwiększone poziomy ekspresji IL-4 i IFN-γ stwierdzono także w modelu ostrej nieuciskowej przepukliny krążka międzykręgowego w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną29. IL-17 odgrywa kluczową rolę w stanach zapalnych, uszkodzeniach tkanek w chorobach autoimmunologicznych30 i wzmacnia odpowiedź immunologiczną na IFN-γ31. Donoszono o wzmożonym uszkodzeniu tkanek za pośrednictwem IL-17 u myszy MRL/lpr32 i myszy podatnych na autoimmunizację33. IL-4 może hamować ekspresję cytokin prozapalnych (takich jak IL-1β i TNFα) oraz aktywację makrofagów34. Doniesiono, że ekspresja mRNA IL-4 była inna w grupie NPE w porównaniu z IL-17 i IFN-γ w tym samym punkcie czasowym; Ekspresja mRNA IFN-γ w grupie NPE była znacząco wyższa niż w pozostałych grupach. Zatem wytwarzanie IFN-γ może być mediatorem odpowiedzi zapalnej indukowanej przez interkalację NP. Badania wykazały, że IFN-γ jest wytwarzany przez wiele typów komórek, w tym aktywowane pomocnicze limfocyty T typu 1, komórki NK i makrofagi35,36, i jest kluczową cytokiną prozapalną, która promuje odpowiedź immunologiczną37.
Badanie to sugeruje, że odpowiedź autoimmunologiczna może mieć związek z występowaniem i rozwojem MC. Luoma i in. odkryli, że charakterystyka sygnału MC i wyraźnego NP jest podobna w MRI i oba wykazują wysoki sygnał w sekwencji T2W38. Potwierdzono, że niektóre cytokiny, takie jak IL-139, są ściśle powiązane z występowaniem MC. Ma i in. zasugerowali, że występ NP w górę lub w dół może mieć ogromny wpływ na występowanie i rozwój MC12. Bobechko40, Herzbein i wsp.41 podają, że NP jest tkanką immunotolerancyjną, która od urodzenia nie może przedostać się do krążenia naczyniowego. Występy NP wprowadzają ciała obce do krwiobiegu, pośrednicząc w ten sposób w lokalnych reakcjach autoimmunologicznych42. Reakcje autoimmunologiczne mogą indukować dużą liczbę czynników odpornościowych, a gdy czynniki te są stale narażone na działanie tkanek, mogą powodować zmiany w sygnalizacji43. W tym badaniu nadekspresja IL-4, IL-17 i IFN-γ są typowymi czynnikami odpornościowymi, co dodatkowo potwierdza ścisły związek między NP i MC44. Ten model zwierzęcy dobrze naśladuje przełom NP i wejście do płytki końcowej. Proces ten dodatkowo ujawnił wpływ autoimmunizacji na MC.
Zgodnie z oczekiwaniami ten model zwierzęcy zapewnia nam możliwą platformę do badania MC. Jednakże model ten nadal ma pewne ograniczenia: po pierwsze, na etapie obserwacji zwierząt, niektóre króliki w pośrednim stadium muszą zostać poddane eutanazji w celu przeprowadzenia badań histologicznych i biologii molekularnej, w związku z czym niektóre zwierzęta z czasem „wypadają z użytku”. Po drugie, chociaż w tym badaniu ustalono trzy punkty czasowe, niestety modelowaliśmy tylko jeden typ MC (zmiana typu Modic I), więc nie wystarczy przedstawić proces rozwoju choroby u człowieka i należy ustawić więcej punktów czasowych, aby lepiej obserwuj wszystkie zmiany sygnału. Po trzecie, zmiany w strukturze tkanki można rzeczywiście wyraźnie wykazać za pomocą barwienia histologicznego, ale niektóre specjalistyczne techniki mogą lepiej ujawnić zmiany mikrostrukturalne w tym modelu. Na przykład mikroskopię w świetle spolaryzowanym zastosowano do analizy tworzenia się chrząstki włóknistej w krążkach międzykręgowych królika45. Długoterminowy wpływ NP na MC i płytkę końcową wymaga dalszych badań.
Pięćdziesiąt cztery samce białych królików nowozelandzkich (waga około 2,5-3 kg, wiek 3-3,5 miesiąca) podzielono losowo na grupę pozorowanej operacji, grupę z implantacją mięśni (grupa ME) i grupę z implantacją korzenia nerwowego (grupa NPE). Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala w Tianjin, a metody eksperymentalne przeprowadzono ściśle według zatwierdzonych wytycznych.
W technice chirurgicznej S. Sobajimy dokonano pewnych udoskonaleń 46 . Każdego królika ułożono w pozycji leżącej na boku i odsłonięto przednią powierzchnię pięciu kolejnych krążków międzykręgowych w odcinku lędźwiowym (IVD), stosując dostęp tylno-boczny zaotrzewnowy. Każdemu królikowi podano znieczulenie ogólne (20% uretan, 5 ml/kg przez żyłę uszną). Wykonano podłużne nacięcie skóry od dolnej krawędzi żeber do brzegu miednicy, 2 cm brzusznie od mięśni przykręgowych. Prawy przednio-boczny kręgosłup od L1 do L6 odsłonięto poprzez ostre i tępe rozcięcie leżącej nad nim tkanki podskórnej, tkanki zaotrzewnowej i mięśni (ryc. 6A). Poziom krążka określono, stosując brzeg miednicy jako anatomiczny punkt odniesienia dla poziomu krążka międzykręgowego L5–L6. Za pomocą igły nakłuwającej nr 16 wywierć otwór w pobliżu płytki końcowej kręgu L5 na głębokość 3 mm (ryc. 6B). Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml odessać autologiczne jądro miażdżyste w krążku międzykręgowym L1-L2 (ryc. 6C). Usuń jądro miażdżyste lub mięsień zgodnie z wymaganiami każdej grupy. Po pogłębieniu otworu zakłada się wchłanialne szwy na powięź głęboką, powięź powierzchowną i skórę, uważając, aby podczas operacji nie uszkodzić tkanki okostnej trzonu kręgu.
(A) Odsłania się krążek L5–L6 z dostępu tylno-bocznego zaotrzewnowego. (B) Za pomocą igły nr 16 wywierć otwór w pobliżu płytki końcowej L5. (C) Zbiera się autologiczne MF.
Zastosowano znieczulenie ogólne 20% uretanem (5 ml/kg) podanym przez żyłę uszną, a zdjęcia rentgenowskie kręgosłupa lędźwiowego powtórzono po 12, 16 i 20 tygodniach po operacji.
Króliki uśmiercano przez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (25,0 mg/kg) i dożylnego pentobarbitalu sodu (1,2 g/kg) w 12, 16 i 20 tygodniu po operacji. Usunięto cały kręgosłup do analizy histologicznej i przeprowadzono analizę rzeczywistą. Do wykrycia zmian w czynnikach odpornościowych zastosowano ilościową odwrotną transkrypcję (RT-qPCR) i Western blot.
Badania MRI przeprowadzono u królików przy użyciu magnesu klinicznego 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) wyposażonego w ortogonalny odbiornik cewki kończynowej. Króliki znieczulono 20% uretanem (5 ml/kg) przez żyłę uszną, a następnie ułożono na wznak w obrębie magnesu, tak aby obszar lędźwiowy był wyśrodkowany na cewce o okrągłej powierzchni o średnicy 5 cali (GE Medical Systems). Uzyskano koronalne obrazy lokalizatora T2-zależne (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) w celu określenia położenia krążka lędźwiowego od L3–L4 do L5–L6. Uzyskano wycinki ważone T2 w płaszczyźnie strzałkowej przy następujących ustawieniach: szybka sekwencja echa spinowego z czasem powtarzania (TR) 2200 ms i czasem echa (TE) 70 ms, matryca; pole widzenia 260 i osiem bodźców; Grubość cięcia wynosiła 2 mm, szczelina 0,2 mm.
Po wykonaniu ostatniego zdjęcia i zabiciu ostatniego królika, krążki pozorowane, osadzone w mięśniach i NP usunięto do badania histologicznego. Tkanki utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez 1 tydzień, odwapniono kwasem etylenodiaminotetraoctowym i pocięto na skrawki parafinowe. Bloki tkanki zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki strzałkowe (o grubości 5 µm) przy użyciu mikrotomu. Skrawki barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E).
Po pobraniu krążków międzykręgowych od królików z każdej grupy ekstrahowano całkowity RNA przy użyciu kolumny UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta i systemem odwrotnej transkrypcji ImProm II (Promega Inc. , Madison, Wisconsin, USA). Przeprowadzono odwrotną transkrypcję.
RT-qPCR przeprowadzono przy użyciu Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) i SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Objętość reakcji PCR wynosiła 20 µl i zawierała 1,5 µl rozcieńczonego cDNA i 0,2 µM każdego startera. Startery zostały zaprojektowane przez OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, Kalifornia) i wyprodukowane przez Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Chiny) (Tabela 1). Zastosowano następujące warunki cykli termicznych: początkowy etap aktywacji polimerazy w 94°C przez 2 minuty, następnie 40 cykli po 15 s każdy w 94°C w celu denaturacji matrycy, przyłączania przez 1 minutę w 60°C, wydłużania i fluorescencji. pomiary prowadzono przez 1 minutę w temperaturze 72°C. Wszystkie próbki amplifikowano trzykrotnie, a średnią wartość wykorzystano do analizy RT-qPCR. Dane dotyczące amplifikacji analizowano przy użyciu FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia, USA). Ekspresję genów IL-4, IL-17 i IFN-γ normalizowano w stosunku do kontroli endogennej (ACTB). Względne poziomy ekspresji docelowego mRNA obliczono przy użyciu metody 2-ΔΔCT.
Białko całkowite ekstrahowano z tkanek przy użyciu homogenizatora tkankowego w buforze do lizy RIPA (zawierającym koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy), a następnie wirowano przy 13 000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 4°C w celu usunięcia resztek tkanek. Na ścieżkę załadowano pięćdziesiąt mikrogramów białka, rozdzielono za pomocą 10% SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membranę PVDF. Blokowanie przeprowadzono w 5% odtłuszczonym mleku w proszku w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) zawierającej 0,1% Tween 20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Błonę inkubowano z króliczym pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko dekorynie (rozcieńczonym 1:200; Boster, Wuhan, Chiny) (rozcieńczonym 1:200; Bioss, Pekin, Chiny) przez noc w temperaturze 4°C i poddano reakcji drugiego dnia; z przeciwciałem wtórnym (kozia antykrólicza immunoglobulina G w rozcieńczeniu 1:40 000) w połączeniu z peroksydazą chrzanową (Boster, Wuhan, Chiny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnały Western blot wykrywano poprzez zwiększoną chemiluminescencję na membranie chemiluminescencyjnej po napromienianiu promieniami rentgenowskimi. Do analizy densytometrycznej skanowano bloty i oceniano ilościowo przy użyciu oprogramowania BandScan, a wyniki wyrażono jako stosunek immunoreaktywności genu docelowego do immunoreaktywności tubuliny.
Obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu pakietu oprogramowania SPSS16.0 (SPSS, USA). Dane zebrane podczas badania wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (średnia ± SD) i poddano analizie za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji powtarzanych pomiarów (ANOVA) w celu określenia różnic między obiema grupami. Za istotny statystycznie uznano P < 0,05.
Zatem stworzenie zwierzęcego modelu MC poprzez wszczepienie autologicznych NP do trzonu kręgu i wykonanie obserwacji makroanatomicznych, analizy MRI, oceny histologicznej i analizy biologii molekularnej może stać się ważnym narzędziem do oceny i zrozumienia mechanizmów ludzkiego MC oraz opracowania nowych terapii interwencje.
Jak cytować ten artykuł: Han, C. i in. Opracowano zwierzęcy model zmian typu Modic poprzez wszczepienie autologicznego jądra miażdżystego w kość podchrzęstną odcinka lędźwiowego kręgosłupa. Nauka. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. i Boos, N. Rezonans magnetyczny kręgosłupa lędźwiowego: częstość występowania przepukliny i zatrzymania dysku, ucisk korzeni nerwowych, nieprawidłowości płytki końcowej i choroba zwyrodnieniowa stawów międzywyrostkowych u bezobjawowych ochotników . wskaźnik. Radiologia 209, 661–666, doi: 10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS i Leboeuf-Eed, K. Modic zmiany i ich związek z wynikami klinicznymi. European Spine Journal: oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Kręgosłupa, Europejskiego Towarzystwa Deformacji Kręgosłupa i Europejskiego Towarzystwa Badań nad Kręgosłupem Szyjnym 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. i in. Modyczne zmiany w płytkach końcowych kręgów lędźwiowych: częstość występowania i związek z bólem krzyża i rwą kulszową u pracowników płci męskiej w średnim wieku. Spine 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. i Dalinka, M. MRI zmian szpiku kostnego w pobliżu płytki końcowej w chorobie zwyrodnieniowej kręgosłupa lędźwiowego. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ i Carter, JR Choroba zwyrodnieniowa krążka międzykręgowego: ocena zmian w szpiku kręgowym za pomocą MRI. Radiologia 166, 193–199, doi: 10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS i Carter, JR Obrazowanie choroby zwyrodnieniowej dysku. Radiologia 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS i in. Predyktory zmian w płytce końcowej neokręgowej (Modic) w populacji ogólnej. European Spine Journal: Oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Kręgosłupa, Europejskiego Towarzystwa Deformacji Kręgosłupa i Europejskiego Towarzystwa Badań nad Kręgosłupem Szyjnym, Oddział 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB i Mannisch, K. Modic zmiany po przepuklinie dysku lędźwiowego. European Spine Journal: Oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Kręgosłupa, Europejskiego Towarzystwa Deformacji Kręgosłupa i Europejskiego Towarzystwa Badań nad Kręgosłupem Szyjnym 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. i Kaapa, E. Zmiany Modic typu I mogą przewidywać szybko postępujące zwyrodnienie krążka deformacyjnego: 1-letnie badanie prospektywne. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ i Fan, SW Zmiany modyczne: możliwe przyczyny i wkład w zwyrodnienie dysku lędźwiowego. Hipotezy medyczne 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Pęknięcie dysku wewnętrznego. Problemy z wypadaniem dysku od 50 lat. Kręgosłup (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Czas publikacji: 13 grudnia 2024 r