Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zalecamy korzystanie z nowszej przeglądarki (lub wyłączania trybu kompatybilności w Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić dalsze wsparcie, wyświetlimy stronę bez stylów i JavaScript.
Ustanowienie modeli zwierzęcych zmian odrobiny (MC) jest ważną podstawą do badania MC. Pięćdziesiąt cztery nowozelandzkie białe króliki zostały podzielone na grupę pozorną, grupę implantacji mięśni (Grupa ME) i grupa implantacyjna pulposus nucleus (grupa NPE). W grupie NPE dysk międzykręgowy został odsłonięty przez przednio -boczne podejście chirurgiczne lędźwiowe i zastosowano igłę do przebicia korpusu kręgowego L5 w pobliżu płyty końcowej. NP wyodrębniono z dysku międzykręgowego L1/2 za pomocą strzykawki i wstrzyknięto do niego. Wiercenie otworu w kości podchrzęstnej. Procedury chirurgiczne i metody wiercenia w grupie implantacji mięśni i grupie pozornej obsługi były takie same jak w grupie implantacyjnej NP. W grupie ME kawałek mięśnia umieszczono w otworze, podczas gdy w grupie pozornej nic nie umieszczono w otworze. Po operacji przeprowadzono skanowanie MRI i badania biologiczne molekularne. Sygnał w grupie NPE zmienił się, ale nie było oczywistej zmiany sygnału w grupie pozornej i grupy ME. Obserwacja histologiczna wykazała, że nieprawidłowa proliferacja tkanki zaobserwowano w miejscu implantacji, a ekspresja IL-4, IL-17 i IFN-γ wzrosła w grupie NPE. Implantacja NP do kości podchrzęstnej może tworzyć zwierzęcy model MC.
Zmiany o rozmiarach (MC) są zmianami krążków kręgowych i sąsiedniego szpiku kostnego widocznego na obrazowaniu rezonansu magnetycznego (MRI). Są one dość powszechne u osób z związanymi z objawami1. Wiele badań podkreśliło znaczenie MC ze względu na jego związek z bólem dolnej części pleców (LBP) 2,3. De Roos i in. 4 i Modic i in.5 niezależnie opisali trzy różne typy nieprawidłowości sygnału podchrzęstnego w szpiku kostnym kręgowego. Zmiany typu I typu I są hipointensem na sekwencjach ważonych T1 (T1W) i hiperintense na sekwencjach ważonych T2 (T2W). Uszkodzenie to ujawnia palety końcowe i sąsiednią tkankę granulacji naczyniowej w szpiku kostnym. Zmiany typu Modic typu II wykazują wysoki sygnał zarówno w sekwencjach T1W, jak i T2W. W tego rodzaju zmianach można znaleźć zniszczenie płyty końcowej, a także histologiczną wymianę tłuszczów sąsiednich szpiku kostnego. Zmiany typu Modic typu III pokazują niski sygnał w sekwencjach T1W i T2W. Zaobserwowano zmiany sklerotyczne odpowiadające strumieniom końcowym6. MC jest uważany za chorobę patologiczną kręgosłupa i jest ściśle związana z wieloma chorobami zwyrodnieniowymi kręgosłupa 7,8,9.
Biorąc pod uwagę dostępne dane, kilka badań dostarczyło szczegółowych informacji na temat etiologii i patologicznych mechanizmów MC. Albert i in. zasugerował, że MC może być spowodowane przepukliną dysku8. Hu i in. przypisano MC ciężkiej degeneracji dysku10. KROC zaproponował pojęcie „wewnętrznego pęknięcia dysku”, które stwierdza, że powtarzająca się uraz dysku może prowadzić do mikrotearów na płycie końcowej. Po utworzeniu rozszczepu zniszczenie płyty końcowej przez jądro pulposus (NP) może wywołać odpowiedź autoimmunologiczną, co dodatkowo prowadzi do rozwoju MC11. Ma i in. udostępnił podobny pogląd i zgłosił, że autoimmuniczność indukowana przez NP odgrywa kluczową rolę w patogenezie MC12.
Komórki układu odpornościowego, zwłaszcza limfocyty pomocnicze CD4+ T, odgrywają kluczową rolę w patogenezie autoimmunizacji13. Niedawno odkryty podzbiór Th17 wytwarza prozapalną cytokinę IL-17, promuje ekspresję chemokin i stymuluje komórki T w uszkodzonych narządach do wytworzenia IFN-γ14. Komórki Th2 odgrywają również unikalną rolę w patogenezie odpowiedzi immunologicznych. Ekspresja IL-4 jako reprezentatywnej komórki Th2 może prowadzić do ciężkich konsekwencji immunopatologicznych15.
Chociaż przeprowadzono wiele badań klinicznych na MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, nadal brakuje odpowiednich modeli eksperymentalnych zwierząt, które mogą naśladować proces MC, który często występuje u ludzi i może być i może być Służy do badania etiologii lub nowych metod leczenia, takich jak terapia ukierunkowana. Do tej pory zgłoszono tylko kilka zwierzęcych modeli MC w celu zbadania leżących u podstaw mechanizmów patologicznych.
W oparciu o teorię autoimmunologiczną zaproponowaną przez Alberta i MA, badanie to wykazało prosty i powtarzalny model króliczego MC poprzez autotransplantowanie NP w pobliżu wierconej płyty końcowej kręgowej. Inne cele to obserwowanie cech histologicznych modeli zwierzęcych i ocena specyficznych mechanizmów NP w rozwoju MC. W tym celu stosujemy techniki takie jak biologia molekularna, MRI i badania histologiczne do zbadania postępu MC.
Dwa króliki zmarły z powodu krwawienia podczas operacji, a cztery króliki zmarły podczas znieczulenia podczas MRI. Pozostałe 48 królików przeżyło i nie wykazywało żadnych objawów behawioralnych lub neurologicznych po operacji.
MRI pokazuje, że intensywność sygnału osadzonej tkanki w różnych otworach jest inna. Intensywność sygnału korpusu kręgowego L5 w grupie NPE stopniowo zmieniała się po 12, 16 i 20 tygodniach po wstawieniu (sekwencja T1W wykazała niski sygnał, a sekwencja T2W wykazała mieszany sygnał plus niski sygnał) (ryc. 1C), podczas gdy wygląd MRI występuje Spośród pozostałych dwóch grup wbudowanych części pozostały względnie stabilne w tym samym okresie (ryc. 1a, b).
(A) Reprezentatywne sekwencyjne MRI królika kręgosłupa lędźwiowego w 3 punktach czasowych. Nie stwierdzono nieprawidłowości sygnału na zdjęciach grupy pozornej. (B) Charakterystyka sygnału ciała kręgowego w grupie ME są podobne do tych w grupie pozornej i nie obserwuje się znaczącej zmiany sygnału w miejscu osadzania w czasie. (C) W grupie NPE niski sygnał jest wyraźnie widoczny w sekwencji T1W, a mieszany sygnał i niski sygnał są wyraźnie widoczne w sekwencji T2W. Od okresu 12-tygodniowego do okresu 20-tygodniowego sporadyczne wysokie sygnały otaczające niskie sygnały w sekwencji T2W zmniejszają się.
Oczywistego przerost kości można zobaczyć w miejscu implantacji ciała kręgowego w grupie NPE, a rozrost kości występuje szybciej od 12 do 20 tygodni (ryc. 2C) w porównaniu z grupą NPE, nie obserwuje się znaczącej zmiany w modelowanych kręgach ciała; Sham Group i ME Group (ryc. 2c) 2a, b).
(A) Powierzchnia ciała kręgowego w wszczepionej porcji jest bardzo gładka, otwór dobrze goje się, a w ciele kręgowym nie ma rozrostu. (B) Kształt wszczepionego miejsca w grupie ME jest podobny do tej w grupie pozornej i nie ma oczywistej zmiany w pojawieniu się wszczepionego miejsca w czasie. (C) Rozrost kości wystąpił w wszczepionym miejscu w grupie NPE. Rozrost kości gwałtownie wzrósł, a nawet rozciągał się przez krążek międzykręgowych do przeciwnego ciała kręgowego.
Analiza histologiczna zawiera bardziej szczegółowe informacje na temat tworzenia kości. Rycina 3 pokazuje zdjęcia sekcji pooperacyjnych zabarwionych H&E. W grupie pozornej chondrocyty były dobrze ułożone i nie wykryto proliferacji komórek (ryc. 3A). Sytuacja w grupie ME była podobna do sytuacji w grupie pozornej (ryc. 3B). Jednak w grupie NPE zaobserwowano dużą liczbę chondrocytów i proliferację komórek podobnych do NP w miejscu implantacji (ryc. 3C);
(A) Trabeculae można zobaczyć w pobliżu płyty końcowej, chondrocyty są starannie ułożone z jednolitym wielkością i kształtem komórki i brak proliferacji (40 razy). (B) Warunek miejsca implantacji w grupie ME jest podobny do stanu grupy pozornej. Trabeculee i chondrocyty można zobaczyć, ale w miejscu implantacji nie ma oczywistej proliferacji (40 razy). (B) Można zauważyć, że chondrocyty i komórki podobne do NP znacznie się prolifują, a kształt i wielkość chondrocytów są nierówne (40 razy).
Ekspresję mRNA interleukiny 4 (IL-4), mRNA interleukiny 17 (IL-17) i mRNA interferonu γ (IFN-γ) zaobserwowano zarówno w grupach NPE, jak i ME. Po porównaniu poziomów ekspresji genów docelowych, ekspresja genów IL-4, IL-17 i IFN-γ była znacznie zwiększona w grupie NPE w porównaniu z poziomami grupy ME i grupy operacyjnej (ryc. 4) (P <0,05). W porównaniu z grupą operacyjną pozorowaną poziomy ekspresji IL-4, IL-17 i IFN-γ w grupie ME wzrosły tylko nieznacznie i nie osiągnęły zmiany statystycznej (p> 0,05).
Ekspresja mRNA IL-4, IL-17 i IFN-γ w grupie NPE wykazała znacznie wyższy trend niż w grupie operacyjnej pozornej i grupie ME (p <0,05).
Natomiast poziomy ekspresji w grupie ME nie wykazały istotnej różnicy (p> 0,05).
Analiza Western blot przeprowadzono przy użyciu dostępnych w handlu przeciwciał przeciwko IL-4 i IL-17 w celu potwierdzenia zmienionego wzoru ekspresji mRNA. Jak pokazano na rysunkach 5A, B, w porównaniu z grupą ME i grupą operacyjną pozorowaną, poziomy białka IL-4 i IL-17 w grupie NPE były znacznie zwiększone (p <0,05). W porównaniu z grupą operacyjną pozorowaną poziomy białka IL-4 i IL-17 w grupie ME również nie osiągnęły statystycznie istotnych zmian (p> 0,05).
(A) Poziomy białka IL-4 i IL-17 w grupie NPE były znacznie wyższe niż w grupie ME i grupie placebo (p <0,05). (B) Histogram Western blot.
Ze względu na ograniczoną liczbę ludzkich próbek uzyskanych podczas operacji jasne i szczegółowe badania patogenezy MC są nieco trudne. Próbowaliśmy ustanowić zwierzęcy model MC w celu zbadania jego potencjalnych mechanizmów patologicznych. W tym samym czasie zastosowano ocenę radiologiczną, ocenę histologiczną i ocenę biologiczną molekularną do postępowania MC indukowanego przez autoprzeszczep NP. W rezultacie model implantacji NP spowodował stopniową zmianę intensywności sygnału z 12-tygodniowych punktów czasowych (mieszany niski sygnał w sekwencjach T1W i niski sygnał w sekwencjach T2W), wskazując zmiany tkanki oraz histologiczne i cząsteczkowe Oceny biologiczne potwierdziły wyniki badania radiologicznego.
Wyniki tego eksperymentu pokazują, że zmiany wizualne i histologiczne wystąpiły w miejscu naruszenia ciała kręgowego w grupie NPE. W tym samym czasie zaobserwowano ekspresję genów IL-4, IL-17 i IFN-γ, a także IL-4, IL-17 i IFN-γ, co wskazuje, że naruszenie autologicznej tkanki jądra pulposus w kręceniu Ciało może powodować szereg zmian sygnałowych i morfologicznych. Łatwo jest stwierdzić, że charakterystyka sygnału ciał kręgowych modelu zwierzęcego (niski sygnał w sekwencji T1W, sygnał mieszany i niski sygnał w sekwencji T2W) są bardzo podobne do charakterystyki ludzkich komórek kręgowych, a także charakterystyka MRI również Potwierdź obserwacje histologii i anatomii rażącej, to znaczy zmiany w komórkach ciała kręgowego są postępujące. Chociaż odpowiedź zapalna spowodowana ostrym urazem może pojawić się wkrótce po nakłuciu, wyniki MRI wykazały, że stopniowo rosnące zmiany sygnału pojawiły się 12 tygodni po nakłuciu i utrzymywały się do 20 tygodni bez żadnych oznak odzyskiwania lub odwrócenia zmian MRI. Wyniki te sugerują, że autologiczna NP kręgów jest niezawodną metodą ustanawiania postępowego MV u królików.
Ten model nakłucia wymaga odpowiedniej umiejętności, czasu i wysiłku chirurgicznego. We wstępnych eksperymentach rozwarstwienie lub nadmierna stymulacja parravertebralnych struktur więzadłowych może powodować powstawanie osteofitów kręgowych. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić lub podrażniać sąsiednie dyski. Ponieważ głębokość penetracji musi być kontrolowana, aby uzyskać spójne i powtarzalne wyniki, ręcznie wykonaliśmy wtyczkę, odcinając pochwę igłę o długości 3 mm. Za pomocą tej wtyczki zapewnia jednolitą głębokość wiercenia w korpusie kręgosłupa. We wstępnych eksperymentach trzech ortopedycznych chirurgów zaangażowanych w operację stwierdziło, że igły o rozmiarze 16 łatwiejsze do pracy z igłami o rozmiarze 18 lub innymi metodami. Aby uniknąć nadmiernego krwawienia podczas wiercenia, trzymanie igły przez pewien czas zapewni bardziej odpowiedni otwór wstawki, co sugeruje, że pewien stopień MC może być kontrolowany w ten sposób.
Chociaż wiele badań ukierunkowało MC, niewiele wiadomo na temat etiologii i patogenezy MC25,26,27. Na podstawie naszych poprzednich badań stwierdziliśmy, że autoimmunizacja odgrywa kluczową rolę w występowaniu i rozwoju MC12. W tym badaniu zbadano ilościową ekspresję IL-4, IL-17 i IFN-γ, które są głównymi szlakami różnicowania komórek CD4+ po stymulacji antygenu. W naszym badaniu, w porównaniu z grupą ujemną, grupa NPE miała wyższą ekspresję IL-4, IL-17 i IFN-γ, a poziomy białka IL-4 i IL-17 były również wyższe.
Klinicznie, ekspresja mRNA IL-17 jest zwiększona w komórkach NP od pacjentów z przepukliną DISK28. Zwiększone poziomy ekspresji IL-4 i IFN-γ stwierdzono również w ostrym niekompresyjnym modelu przepukliny dysku w porównaniu ze zdrowymi Controls29. IL-17 odgrywa kluczową rolę w zapaleniu, uszkodzeniu tkanki w chorobach autoimmunologicznych30 i zwiększa odpowiedź immunologiczną na IFN-γ31. Zwiększone uszkodzenie tkanki za pośrednictwem IL-17 zgłoszono u myszy MRL/LPR32 i myszy podatnych na autoimmunizacje 33. IL-4 może hamować ekspresję cytokin prozapalnych (takich jak IL-1β i TNFα) i aktywacji makrofagów34. Doniesiono, że ekspresja mRNA IL-4 była inna w grupie NPE w porównaniu z IL-17 i IFN-γ w tym samym punkcie czasowym; Ekspresja mRNA IFN-γ w grupie NPE była znacznie wyższa niż w innych grupach. Dlatego produkcja IFN-γ może być mediatorem odpowiedzi zapalnej indukowanej przez interkalację NP. Badania wykazały, że IFN-γ jest wytwarzane przez wiele typów komórek, w tym aktywowane komórki T typu 1, naturalne komórki zabójcze i makrofagi35,36 i jest kluczową cytokiną prozapalną, która promuje odpowiedzi immunologiczne37.
To badanie sugeruje, że odpowiedź autoimmunologiczna może być zaangażowana w występowanie i rozwój MC. Luoma i in. stwierdził, że charakterystyka sygnału MC i widocznego NP są podobne na MRI i oba wykazują wysoki sygnał w sekwencji T2W38. Potwierdzono, że niektóre cytokiny są ściśle związane z występowaniem MC, takimi jak IL-139. Ma i in. zasugerował, że występ NP w górę lub w dół może mieć duży wpływ na występowanie i rozwój MC12. Bobechko40 i Herzbein i wsp Występy NP wprowadzają ciała obce do zaopatrzenia krwi, pośrednicząc w ten sposób lokalne reakcje autoimmunologiczne 42. Reakcje autoimmunologiczne mogą indukować dużą liczbę czynników odpornościowych, a gdy czynniki te są stale narażone na tkanki, mogą powodować zmiany w sygnalizacji43. W tym badaniu nadekspresja IL-4, IL-17 i IFN-γ jest typowymi czynnikami odpornościowymi, co dodatkowo dowodzi bliski związek między NP i MCS44. Ten model zwierzęcy dobrze naśladuje przełom NP i wejście do płyty końcowej. Proces ten dodatkowo ujawnił wpływ autoimmunizacji na MC.
Zgodnie z oczekiwaniami ten model zwierząt zapewnia nam możliwą platformę do badania MC. Jednak ten model nadal ma pewne ograniczenia: po pierwsze, podczas fazy obserwacji zwierząt niektóre króliki średniego stadium muszą być uśmiercane do testów biologii histologicznej i molekularnej, więc niektóre zwierzęta „wypadają z czasów” w czasie. Po drugie, chociaż w tym badaniu ustawione są trzy punkty czasowe, niestety modelowaliśmy tylko jeden rodzaj MC (zmiana typu MC), więc nie wystarczy reprezentować proces rozwoju chorób ludzkich, a więcej punktów czasowych należy ustalić Lepiej obserwuj wszystkie zmiany sygnału. Po trzecie, zmiany struktury tkanki można naprawdę wyraźnie pokazać przez barwienie histologiczne, ale niektóre wyspecjalizowane techniki mogą lepiej ujawnić zmiany mikrostrukturalne w tym modelu. Na przykład spolaryzowana mikroskopia świetlna zastosowano do analizy tworzenia fibokartylage w dyskach międzykręgowych królika 45. Długoterminowy wpływ NP na MC i SPRABRED wymaga dalszych badań.
Pięćdziesiąt cztery męskie białe króliki nowozelandzkie (waga około 2,5-3 kg, wiek 3-3,5 miesiąca) losowo podzielono na pozorowaną grupę operacyjną, grupę implantacji mięśni (Grupa ME) i grupa implantacji korzeni nerwowych (grupa NPE). Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki szpitala Tianjin, a metody eksperymentalne przeprowadzono ściśle zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
Wprowadzono pewne ulepszenia w technice chirurgicznej S. sobajima 46. Każdy królik umieszczono w bocznej pozycji leżącej, a przednią powierzchnię pięciu kolejnych dysków międzykręgowych lędźwiowych (IVDS) eksponowano przy użyciu podstawowego podejścia zaotrzewnowego. Każdemu królika otrzymano znieczulenie ogólne (20% uretan, 5 ml/kg przez żyłę ucha). Wzdłużne nacięcie skóry wykonano z dolnej krawędzi żeber do rondu miednicy, 2 cm brzusznej do mięśni paravertebralnych. Prawy przednio -boczny kręgosłup z L1 do L6 został odsłonięty przez ostre i tępe rozwarstwienie leżącej tkanki podskórnej, tkanki zaotrzewnowej i mięśni (ryc. 6A). Poziom dysku określono za pomocą brzegu miednicy jako anatomicznego punktu orientacyjnego dla poziomu dysku L5-L6. Użyj igły nakłucia 16, aby wywiercić otwór w pobliżu płyty końcowej kręgu L5 na głębokości 3 mm (ryc. 6b). Użyj 5-ml strzykawki, aby aspirować autologiczne jądro miazgi w dysku międzykręgowym L1-L2 (ryc. 6C). Wyjmij jądro pulposus lub mięśnie zgodnie z wymaganiami każdej grupy. Po pogłębieniu otworu wiertła wchłaniane szwy są umieszczane na głębokiej powięzi, powierzchownej powięzi i skórze, uważając, aby nie uszkodzić tkanki okostnej ciała kręgowego podczas operacji.
(A) Dysk L5 - L6 jest eksponowany przez podejście zaotrzewnowe tylno -boczne. (B) Użyj igły o rozmiarze 16, aby wywiercić otwór w pobliżu płyty końcowej L5. (C) Zbierane są autologiczne MF.
Znieczulenie ogólne podawano 20% uretan (5 ml/kg) podawane przez żyłę ucha, a radiogramy kręgosłupa lędźwiowego powtórzono po 12, 16 i 20 tygodniach po operacji.
Króliki uśmiercano przez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (25,0 mg/kg) i dożylnego pentobarbitalu sodu (1,2 g/kg) po 12, 16 i 20 tygodniach po operacji. Cały kręgosłup usunięto do analizy histologicznej i przeprowadzono realną analizę. Do wykrywania zmian czynników odpornościowych zastosowano ilościową odwrotną transkrypcję (RT-QPCR) i Western blotting.
Badania MRI przeprowadzono u królików przy użyciu magnesu klinicznego 3,0 t (GE Medical Systems, Florence, SC) wyposażonego w ortogonalny odbiornik cewki kończyn. Króliki znieczulono 20% uretanem (5 ml/kg) przez żyłę ucha, a następnie umieszczono na plecach w magnesie z regionem lędźwiowym wyśrodkowanym na 5-calowej cewce powierzchniowej o średnicy o średnicy (GE Medical Systems). Obrazy lokalizacyjne ważonego T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) uzyskano w celu zdefiniowania lokalizacji dysku lędźwiowego od L3-L4 do L5-L6. Plasterki ważone T2 płaszczyzny strzałkowej uzyskano z następującymi ustawieniami: Szybka sekwencja spin-ocho z czasem powtarzania (TR) 2200 ms i czasem echa (TE) 70 ms, matryca; pole widzenia 260 i ośmiu bodźców; Grubość cięcia wynosiła 2 mm, szczelina wynosiła 0,2 mm.
Po zrobieniu ostatniego zdjęcia i zabitych ostatnich królików, pozorne, złożone mięśnie i dyski NP zostały usunięte do badania histologicznego. Tkanki utrwalono w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 1 tydzień, odkładano za pomocą kwasu etylenodiaminotetraoctowego i odcinam parafiny. Bloki tkankowe osadzono w parafinie i pocięte na skrawki strzałkowe (grubość 5 μm) przy użyciu mikrotomu. Skrawki zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E).
Po zebraniu dysków międzykręgowych z królików w każdej grupie, całkowity RNA ekstrahowano za pomocą kolumny Uniq-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Chiny), zgodnie z instrukcjami producenta i systemem transkrypcji Improm II (Promega Inc. , Madison, WI, USA). Przeprowadzono odwrotną transkrypcję.
RT-QPCR przeprowadzono przy użyciu Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) i Sybr Green Jump Start Taq Readimix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Objętość reakcji PCR wynosiła 20 μl i zawierała 1,5 μl rozcieńczonego cDNA i 0,2 μm każdego startera. Startery zostały zaprojektowane przez Oligoperfect Designer (Invitrogen, Valencia, Kalifornia) i wyprodukowane przez Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Chiny) (Tabela 1). Zastosowano następujące warunki cyklu termicznego: początkowy etap aktywacji polimerazy w 94 ° C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli po 15 sekund w 94 ° C dla denaturacji szablonowej, wyżarzanie przez 1 min w 60 ° C, wydłużenie i fluorescencja. Pomiary przeprowadzono przez 1 min w 72 ° C. Wszystkie próbki wzmocniono trzykrotnie, a średnią wartość zastosowano do analizy RT-QPCR. Dane dotyczące amplifikacji analizowano przy użyciu FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ekspresja genu IL-4, IL-17 i IFN-γ znormalizowano do kontroli endogennej (ACTB). Względne poziomy ekspresji docelowego mRNA obliczono przy użyciu metody 2-δCTT.
Całkowite białko ekstrahowano z tkanek przy użyciu homogenizatora tkanki w buforze do lizy RIPA (zawierającego koktajl proteazy i inhibitora fosfatazy), a następnie wirowano przy 13 000 rpm przez 20 minut w 4 ° C w celu usunięcia gruzu tkankowego. Pięćdziesiąt mikrogramów białka załadowano na linię, oddzielono 10% SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na błonę PVDF. Blokowanie przeprowadzono w 5% beztłuszczowym suchym mleku w soli fizjologicznej (TBS) zawierającego 0,1% Tween 20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Membranę inkubowano z króliczym przeciwciałem przeciwdecorycznym (rozcieńczonym 1: 200; Boster, Wuhan, Chiny) (rozcieńczono 1: 200; Bioss, Pekin, Chiny) przez noc w 4 ° C i reakcji w drugie dni; z wtórnym przeciwciałem (kozą anty-króliczną immunoglobuliną G o rozcieńczeniu 1: 40 000) w połączeniu z peroksydazą chrzanową (Boster, Wuhan, Chiny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnały Western blot wykryto przez zwiększoną chemiluminescencję na błonie chemiluminescencyjnej po napromieniowaniu rentgenowskim. Do analizy densytometrycznej bloty skanowano i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania Bandscan, a wyniki wyrażono jako stosunek docelowej immunoreaktywności genu do immunoreaktywności tubuliny.
Obliczenia statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania SPSS16.0 (SPSS, USA). Dane zebrane podczas badania wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (średnia ± SD) i analizowano przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji powtarzanych miar (ANOVA) w celu określenia różnic między dwiema grupami. P <0,05 uznano za statystycznie istotny.
Zatem ustanowienie zwierzęcego modelu MC poprzez wszczepienie autologicznych NP do ciała kręgowego i wykonanie obserwacji makroanatomicznej, analizy MRI, oceny histologicznej i analizy biologicznej molekularnej może stać się ważnym narzędziem oceny i zrozumienia mechanizmów ludzkiego MC i opracowywanie nowych terapeutyków interwencje.
Jak cytować ten artykuł: Han, C. i in. Model zwierząt zmian rozmiarów ustalono przez wszczepienie autologicznego jądra miazgi do kości podchrzęstnej kręgosłupa lędźwiowego. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., i Boos, N. Obrazowanie rezonansu magnetycznego kręgosłupa lędźwiowego: rozpowszechnienie przepukliny i retencji, ściskanie korzeni nerwowych, nieprawidłowości płytki końcowej i stawu osteoarniste . wskaźnik. Radiology 209, 661–666, doi: 10.1148/Radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS i LeBoeuf-EED, K. Modic Change i ich związek z ustaleniami klinicznymi. Europejski czasopismo kręgosłupa: Oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Spine, The European Society of Spinal Deformity i Europejskie Towarzystwo Badań Kręgosłupa szyjnego 15, 1312–1319, DOI: 10.1007/S00586-006-0185-X (2006).
Kuisma, M., i in. Modowe zmiany w lędźwiowych płytach końcowych: rozpowszechnienie i powiązanie z bólem kręgosłupa i kulszą kulszową u mężczyzn w średnim wieku. Spine 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. i Dalinka, M. MRI zmian szpiku kostnego w pobliżu płyty końcowej w chorobie zwyrodnieniowej kręgosłupa lędźwiowego. Ajr. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/AJR.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ i Carter, JR zwyrodnienie krążka: ocena zmian szpiku kręgowego za pomocą MRI. Radiology 166, 193–199, doi: 10.1148/Radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS i Carter, Jr obrazowanie choroby zwyrodnieniowej dysku. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/Radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS i in. Predyktory neovertebralnych zmian sygnału (MODIC) w populacji ogólnej. Europejski czasopismo kręgosłupa: Oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Spine, The European Society of Spinal Deformity i European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, DOI: 10.1007/S00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB i Mannisch, K. Modic Change po przepuklinie dysku lędźwiowego. Europejski czasopismo kręgosłupa: oficjalna publikacja Europejskiego Towarzystwa Spine, The European Society of Spinal Deformity i European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., i Kaapa, E. Zmiany typu I typu I mogą przewidzieć szybko postępujące degenerację dysku deformacyjnych: roczne badanie prospektywne. European Spine Journal 21, 1135–1142, DOI: 10.1007/S00586-012-2147-9 (2012).
HU, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ i Fan, SW Zmiany modowe: Możliwe przyczyny i wkład w zwyrodnienie dysku lędźwiowego. Hipotezy medyczne 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Wewnętrzne pęknięcie dysku. Problemy z wypadaniem dysku w ciągu 50 lat. Spine (Phila PA 1976) 11, 650–653 (1986).
Czas postu: DEC-13-2024