Dziękujemy za odwiedzenie strony nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z najnowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Dodatkowo, aby zapewnić ciągłą obsługę, ta strona będzie wolna od stylów i JavaScriptu.
Mięsień szkieletowy jest tkanką heterogeniczną, zbudowaną głównie z miofibryli, które u ludzi zazwyczaj klasyfikuje się do trzech typów: jednego „wolnego” (typ 1) i dwóch „szybkich” (typy 2A i 2X). Jednak heterogeniczność między tradycyjnymi typami miofibryli i w ich obrębie pozostaje słabo poznana. Zastosowaliśmy metody transkryptomiczne i proteomiczne do odpowiednio 1050 i 1038 pojedynczych miofibryli z ludzkiego mięśnia obszernego bocznego. Badanie proteomiczne objęło mężczyzn, a badanie transkryptomiczne objęło 10 mężczyzn i 2 kobiety. Oprócz izoform łańcuchów ciężkich miozyny, zidentyfikowaliśmy białka metaboliczne, białka rybosomalne i białka połączeń komórkowych jako źródła wielowymiarowej zmienności międzymiofibryli. Ponadto, pomimo identyfikacji skupisk włókien wolnych i szybkich, nasze dane sugerują, że włókna typu 2X są fenotypowo nieodróżnialne od innych włókien szybkokurczliwych. Co więcej, klasyfikacja oparta na łańcuchach ciężkich miozyny jest niewystarczająca do opisania fenotypu włókien mięśniowych w miopatiach nemalinowych. Ogólnie rzecz biorąc, nasze dane sugerują wielowymiarową heterogeniczność włókien mięśniowych, ze źródłami zmienności wykraczającymi poza izoformy łańcuchów ciężkich miozyny.
Heterogeniczność komórkowa jest nieodłączną cechą wszystkich układów biologicznych, umożliwiającą komórkom specjalizację w celu zaspokojenia różnych potrzeb tkanek i komórek.1 Tradycyjny pogląd na heterogeniczność włókien mięśni szkieletowych opierał się na tym, że neurony ruchowe definiują typ włókna w jednostce ruchowej, a typ włókna (tj. typ 1, typ 2A i typ 2X u ludzi) jest określany przez cechy izoform ciężkiego łańcucha miozyny (MYH).2 Początkowo opierało się to na niestabilności ich pH-ATPazy,3,4 a później na ich molekularnej ekspresji MYH.5 Jednak wraz z identyfikacją i późniejszą akceptacją „mieszanych” włókien, które współeksprymują wiele MYH w różnych proporcjach, włókna mięśni szkieletowych są coraz częściej postrzegane jako kontinuum, a nie jako odrębne typy włókien.6 Pomimo tego, dziedzina ta nadal w dużym stopniu opiera się na MYH jako podstawowym klasyfikatorze klasyfikacji włókien mięśniowych, co prawdopodobnie wynika z ograniczeń i znacznych błędów systematycznych wczesnych badań na gryzoniach, których profile ekspresji MYH i zakres typów włókien różnią się od tych w ludzi.2 Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że różne mięśnie szkieletowe człowieka wykazują różnorodne typy włókien.7 Mięsień obszerny boczny jest mięśniem mieszanym o pośrednim (a zatem reprezentatywnym) profilu ekspresji MYH.7 Co więcej, łatwość pobierania próbek sprawia, że jest to najlepiej zbadany mięsień u ludzi.
Zatem obiektywne badanie różnorodności włókien mięśni szkieletowych z wykorzystaniem zaawansowanych narzędzi „omicznych” jest kluczowe, ale jednocześnie trudne, częściowo ze względu na wielojądrową naturę włókien mięśni szkieletowych. Jednakże technologie transkryptomiki8,9 i proteomiki10 przeszły w ostatnich latach rewolucję pod względem czułości dzięki różnym postępom technologicznym, umożliwiając analizę mięśni szkieletowych z rozdzielczością pojedynczych włókien. W rezultacie poczyniono znaczny postęp w charakterystyce różnorodności pojedynczych włókien i ich reakcji na bodźce zanikowe i starzenie się11,12,13,14,15,16,17,18. Co ważne, te postępy technologiczne mają zastosowanie kliniczne, umożliwiając bardziej szczegółową i precyzyjną charakterystykę zaburzeń regulacji związanych z chorobami. Na przykład patofizjologia miopatii nemalinowej, jednej z najczęstszych dziedzicznych chorób mięśni (MIM 605355 i MIM 161800), jest złożona i niejasna.19,20 Dlatego też lepsze scharakteryzowanie dysregulacji włókien mięśni szkieletowych mogłoby przyczynić się do znacznego postępu w naszej wiedzy na temat tej choroby.
Opracowaliśmy metody analizy transkryptomicznej i proteomicznej pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, ręcznie izolowanych z ludzkich próbek biopsyjnych, i zastosowaliśmy je do tysięcy włókien, co pozwoliło nam zbadać heterogeniczność komórkową ludzkich włókien mięśni szkieletowych. W toku tych badań zademonstrowaliśmy potencjał fenotypowania transkryptomicznego i proteomicznego włókien mięśniowych oraz zidentyfikowaliśmy białka metaboliczne, rybosomalne i połączeń komórkowych jako istotne źródła zmienności międzywłókiennej. Ponadto, stosując ten schemat pracy proteomicznej, scharakteryzowaliśmy kliniczne znaczenie miopatii nicieniowej w pojedynczych włóknach mięśni szkieletowych, ujawniając skoordynowane przesunięcie w kierunku włókien nieoksydacyjnych, niezależnie od typu włókien na podstawie MYH.
Aby zbadać heterogeniczność włókien mięśni szkieletowych człowieka, opracowaliśmy dwa schematy pracy umożliwiające analizę transkryptomu i proteomu pojedynczych włókien mięśni szkieletowych (Rysunek 1A i Rysunek uzupełniający 1A). Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy kilka etapów metodologicznych, od przechowywania próbek i zachowania integralności RNA i białek po optymalizację przepustowości dla każdego podejścia. W przypadku analizy transkryptomu osiągnięto to poprzez wstawienie specyficznych dla próbki kodów kreskowych molekularnych na początkowym etapie odwrotnej transkrypcji, co umożliwiło połączenie 96 włókien w celu wydajnego dalszego przetwarzania. Głębsze sekwencjonowanie (±1 milion odczytów na włókno) w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na pojedynczych komórkach dodatkowo wzbogaciło dane transkryptomu. 21 W proteomice zastosowaliśmy krótki gradient chromatograficzny (21 minut) w połączeniu z akwizycją danych DIA-PASEF na spektrometrze mas timsTOF, aby zoptymalizować głębokość proteomu przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej przepustowości. 22,23 Aby zbadać heterogeniczność zdrowych włókien mięśni szkieletowych, scharakteryzowaliśmy transkryptomy 1050 pojedynczych włókien od 14 zdrowych dorosłych dawców oraz proteomy 1038 włókien od 5 zdrowych dorosłych dawców (Tabela uzupełniająca 1). W niniejszym artykule te zestawy danych są określane odpowiednio jako transkryptomy i proteomy 1000 włókien. Nasze podejście wykryło łącznie 27 237 transkryptów i 2983 białek w analizach transkryptomowych i proteomicznych 1000 włókien (Rysunek 1A, Zestawy uzupełniające 1–2). Po przefiltrowaniu zestawów danych transkryptomowych i proteomicznych pod kątem >1000 wykrytych genów i 50% prawidłowych wartości na włókno, przeprowadzono kolejne analizy bioinformatyczne dla 925 i 974 włókien w transkryptomie i proteomie, odpowiednio. Po filtracji wykryto średnio 4257 ± 1557 genów i 2015 ± 234 białek (średnia ± SD) na włókno, z ograniczoną zmiennością międzyosobniczą (rysunki uzupełniające 1B–C, zestawy danych uzupełniających 3–4). Jednak zmienność wewnątrzosobnicza była wyraźniejsza u poszczególnych uczestników, prawdopodobnie ze względu na różnice w wydajności RNA/białka między włóknami o różnej długości i powierzchni przekroju poprzecznego. Dla większości białek (>2000) współczynnik zmienności wynosił poniżej 20% (rysunek uzupełniający 1D). Obie metody pozwoliły na uchwycenie szerokiego zakresu dynamicznego transkryptów i białek o silnie ekspresjonowanych sygnaturach istotnych dla skurczu mięśni (np. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (rysunki uzupełniające 1E–F). Większość zidentyfikowanych cech była wspólna dla zestawów danych transkryptomowych i proteomowych (rysunek uzupełniający 1G), a średnie natężenia UMI/LFQ tych cech były w miarę dobrze skorelowane (r = 0,52) (rysunek uzupełniający 1H).
Przebieg pracy w transkryptomice i proteomice (utworzony za pomocą BioRender.com). Krzywe BD Dynamic Range dla MYH7, MYH2 i MYH1 oraz obliczone progi dla przypisania typu włókien. E, F Rozkład ekspresji MYH we włóknach w zestawach danych transkryptomiki i proteomiki. G, H Wykresy UMAP (Uniform Diversity Approximation and Projection) dla transkryptomiki i proteomiki pokolorowane według typu włókien na podstawie MYH. I, J Wykresy cech przedstawiające ekspresję MYH7, MYH2 i MYH1 w zestawach danych transkryptomiki i proteomiki.
Początkowo postanowiliśmy przypisać typ włókna oparty na MYH do każdego włókna, wykorzystując zoptymalizowane podejście, które wykorzystuje wysoką czułość i zakres dynamiki ekspresji MYH w zestawach danych omikowych. Wcześniejsze badania wykorzystywały arbitralne progi do oznaczania włókien jako czystego typu 1, typu 2A, typu 2X lub mieszanego w oparciu o stały procent ekspresji różnych MYH11,14,24. Zastosowaliśmy inne podejście, w którym ekspresja każdego włókna była klasyfikowana według MYH, których użyliśmy do ich typowania: MYH7, MYH2 i MYH1, odpowiadających odpowiednio włóknom typu 1, typu 2A i typu 2X. Następnie matematycznie obliczyliśmy dolny punkt przegięcia każdej wynikowej krzywej i użyliśmy go jako progu do przypisania włókien jako dodatnich (powyżej progu) lub ujemnych (poniżej progu) dla każdego MYH (Rysunek 1B–D). Dane te pokazują, że MYH7 (ryc. 1B) i MYH2 (ryc. 1C) charakteryzują się bardziej zróżnicowanymi profilami ekspresji on/off na poziomie RNA w porównaniu z poziomem białka. Co więcej, na poziomie białka bardzo niewiele włókien nie wykazywało ekspresji MYH7, a żadne włókno nie wykazywało 100% ekspresji MYH2. Następnie, wykorzystując ustalone progi ekspresji, przypisaliśmy typy włókien oparte na MYH do wszystkich włókien w każdym zestawie danych. Na przykład, włókna MYH7+/MYH2-/MYH1- przypisano do typu 1, podczas gdy włókna MYH7-/MYH2+/MYH1+ przypisano do typu mieszanego 2A/2X (pełny opis znajduje się w Tabeli uzupełniającej 2). Łącząc wszystkie włókna, zaobserwowaliśmy zadziwiająco podobny rozkład typów włókien opartych na MYH zarówno na poziomie RNA (ryc. 1E), jak i białka (ryc. 1F), podczas gdy względny skład typów włókien opartych na MYH różnił się u poszczególnych osób, zgodnie z oczekiwaniami (Ryc. uzupełniająca 2A). Większość włókien została sklasyfikowana jako czysty typ 1 (34–35%) lub typ 2A (36–38%), chociaż wykryto również znaczną liczbę włókien mieszanych typu 2A/2X (16–19%). Uderzającą różnicą jest to, że czyste włókna typu 2X można było wykryć tylko na poziomie RNA, a nie na poziomie białka, co sugeruje, że szybka ekspresja MYH jest przynajmniej częściowo regulowana potranskrypcyjnie.
Zwalidowaliśmy naszą metodę typowania włókien MYH opartą na proteomice, wykorzystując technikę blottingu punktowego z przeciwciałami, a obie metody osiągnęły 100% zgodność w identyfikacji czystych włókien typu 1 i typu 2A (patrz Rysunek uzupełniający 2B). Jednak podejście oparte na proteomice było bardziej czułe i skuteczniejsze w identyfikacji włókien mieszanych oraz w ilościowym określaniu udziału każdego genu MYH w każdym włóknie. Dane te dowodzą skuteczności obiektywnego, wysoce czułego podejścia opartego na omice w charakterystyce typów włókien mięśni szkieletowych.
Następnie wykorzystaliśmy połączone informacje uzyskane z transkryptomiki i proteomiki do obiektywnej klasyfikacji włókien mięśniowych na podstawie ich pełnego transkryptomu lub proteomu. Stosując metodę przybliżenia i projekcji rozmaitości jednorodnej (UMAP) w celu zredukowania wymiarowości do sześciu głównych składowych (rysunki uzupełniające 3A–B), byliśmy w stanie zwizualizować zmienność włókien mięśniowych w transkryptomie (rysunek 1G) i proteomie (rysunek 1H). Co istotne, włókna mięśniowe nie były grupowane według uczestników (rysunki uzupełniające 3C–D) ani według dni badań (rysunek uzupełniający 3E) ani w zestawach danych transkryptomiki, ani proteomiki, co sugeruje, że zmienność wewnątrzosobnicza włókien mięśniowych szkieletowych jest wyższa niż zmienność międzyosobnicza. Na wykresie UMAP wyłoniły się dwa odrębne skupiska reprezentujące „szybkie” i „wolne” włókna mięśniowe (rysunki 1G–H). Miowłókna MYH7+ (wolne) skupiały się na biegunie dodatnim UMAP1, podczas gdy miowłókna MYH2+ i MYH1+ (szybkie) skupiały się na biegunie ujemnym UMAP1 (rysunki 1I–J). Nie dokonano jednak rozróżnienia między typami włókien szybkokurczliwych (tj. typu 2A, typu 2X lub mieszanych 2A/2X) na podstawie ekspresji MYH, co sugeruje, że ekspresja MYH1 (rysunek 1I–J) lub innych klasycznych markerów miowłókni 2X, takich jak ACTN3 lub MYLK2 (rysunki uzupełniające 4A–B), nie różnicuje różnych typów miowłókni, biorąc pod uwagę cały transkryptom lub proteom. Ponadto, w porównaniu z MYH2 i MYH7, niewiele transkryptów lub białek było dodatnio skorelowanych z MYH1 (rysunki uzupełniające 4C–H), co sugeruje, że obfitość MYH1 nie odzwierciedla w pełni transkryptomu/proteomu miowłókni. Podobne wnioski wyciągnięto, oceniając mieszaną ekspresję trzech izoform MYH na poziomie UMAP (rysunki uzupełniające 4I–J). Zatem, o ile włókna 2X można zidentyfikować na poziomie transkryptu wyłącznie na podstawie kwantyfikacji MYH, o tyle włókna MYH1+ nie są odróżnialne od innych szybkich włókien, biorąc pod uwagę cały transkryptom lub proteom.
W ramach wstępnej eksploracji heterogeniczności włókien wolnych poza MYH, oceniliśmy cztery ustalone białka specyficzne dla typu włókien wolnych: TPM3, TNNT1, MYL3 i ATP2A22. Podtypy włókien wolnych wykazywały wysokie, choć nie idealne, korelacje Pearsona z MYH7 zarówno w transkryptomice (Rysunek uzupełniający 5A), jak i proteomice (Rysunek uzupełniający 5B). Około 25% i 33% włókien wolnych nie zostało sklasyfikowanych jako czyste włókna wolne przez wszystkie podtypy genów/białek w transkryptomice (Rysunek uzupełniający 5C) i proteomice (Rysunek uzupełniający 5D). Dlatego klasyfikacja włókien wolnych oparta na wielu podtypach genów/białek wprowadza dodatkową złożoność, nawet w przypadku białek znanych jako specyficzne dla typu włókien. Sugeruje to, że klasyfikacja włókien oparta na izoformach pojedynczej rodziny genów/białek może nie odzwierciedlać w sposób adekwatny rzeczywistej heterogeniczności włókien mięśni szkieletowych.
Aby dokładniej zbadać zmienność fenotypową włókien mięśni szkieletowych człowieka w skali całego modelu omikowego, przeprowadziliśmy nieobciążoną redukcję wymiarowości danych za pomocą analizy głównych składowych (PCA) (rysunek 2A). Podobnie jak w przypadku wykresów UMAP, ani uczestnik, ani dzień badania nie wpłynęły na klasteryzację włókien na poziomie PCA (rysunki uzupełniające 6A–C). W obu zbiorach danych typ włókien oparty na MYH został wyjaśniony przez PC2, który wykazał klaster włókien wolnokurczliwych typu 1 oraz drugi klaster zawierający włókna szybkokurczliwe typu 2A, typu 2X oraz mieszane 2A/2X (rysunek 2A). W obu zbiorach danych te dwa klastry były połączone niewielką liczbą włókien mieszanych typu 1/2A. Zgodnie z oczekiwaniami, analiza nadreprezentacji głównych czynników PC potwierdziła, że PC2 był napędzany przez sygnatury skurczowe i metaboliczne (rysunek 2B i rysunki uzupełniające 6D–E, zestawy uzupełniające 5–6). Ogólnie stwierdzono, że typ włókien oparty na MYH wystarcza do wyjaśnienia ciągłej zmienności wzdłuż PC2, z wyjątkiem tzw. włókien 2X, które były rozmieszczone w całym transkryptomie w obrębie szybkiego klastra.
A. Wykresy analizy głównych składowych (PCA) zestawów danych transkryptomu i proteomu pokolorowane według typu włókna na podstawie MYH. B. Analiza wzbogacenia sterowników transkryptu i białka w PC2 i PC1. Analizę statystyczną przeprowadzono z użyciem pakietu clusterProfiler i skorygowanych wartości p Benjaminiego-Hochberga. C, D. Wykresy PCA pokolorowane według terminów ontologii genu adhezji międzykomórkowej (GO) w transkryptomie i terminów GO kostameru w proteomie. Strzałki reprezentują sterowniki transkryptu i białka oraz ich kierunki. E, F. Wykresy cech klinicznie istotnych, wykorzystujące przybliżenie i projekcję rozmaitości jednorodnej (UMAP), pokazujące gradienty ekspresji niezależne od typu włókna wolnego/szybkiego. G, H. Korelacje między sterownikami PC2 i PC1 w transkryptomach i proteomach.
Nieoczekiwanie, typ włókien mięśniowych oparty na MYH wyjaśnił jedynie drugi pod względem wielkości stopień zmienności (PC2), co sugeruje, że inne czynniki biologiczne niezwiązane z typem włókien mięśniowych opartym na MYH (PC1) odgrywają istotną rolę w regulacji heterogeniczności włókien mięśni szkieletowych. Analiza nadreprezentacji głównych czynników determinujących PC1 wykazała, że zmienność PC1 była determinowana przede wszystkim przez adhezję międzykomórkową i zawartość rybosomów w transkryptomie oraz kostamery i białka rybosomalne w proteomie (rycina 2B i ryciny uzupełniające 6D–E, zestaw danych uzupełniających 7). W mięśniach szkieletowych kostamery łączą dysk Z z sarkolemmą i uczestniczą w przekazywaniu siły oraz sygnalizacji. 25 adnotowanych wykresów PCA wykorzystujących cechy adhezji komórka-komórka (transkryptom, rycina 2C) i kostameru (proteom, rycina 2D) ujawniło silne przesunięcie w lewo w PC1, co wskazuje, że cechy te są wzbogacone w niektórych włóknach.
Bardziej szczegółowa analiza klastrowania włókien mięśniowych na poziomie UMAP wykazała, że większość cech wykazywała niezależny od typu włókien mięśniowych gradient ekspresji MYH, a nie była specyficzna dla podklastra włókien mięśniowych. Tę ciągłość zaobserwowano dla kilku genów związanych ze stanami patologicznymi (ryc. 2E), takich jak CHCHD10 (choroby nerwowo-mięśniowe), SLIT3 (zanik mięśni), CTDNEP1 (choroby mięśni). Tę ciągłość zaobserwowano również w całym proteomie, w tym w białkach związanych z zaburzeniami neurologicznymi (UGDH), sygnalizacją insuliny (PHIP) i transkrypcją (HIST1H2AB) (ryc. 2F). Łącznie dane te wskazują na ciągłość w niezależnej od typu włókien heterogeniczności skurczów wolnych/szybkich w różnych włóknach mięśniowych.
Co ciekawe, geny sterujące w PC2 wykazały dobrą korelację transkryptomu z proteomem (r = 0,663) (ryc. 2G), co sugeruje, że typy włókien wolno- i szybkokurczliwych, a w szczególności właściwości kurczliwe i metaboliczne włókien mięśni szkieletowych, są regulowane transkrypcyjnie. Jednakże geny sterujące w PC1 nie wykazały korelacji transkryptomu z proteomem (r = -0,027) (ryc. 2H), co sugeruje, że wariacje niezwiązane z typami włókien wolno-/szybkokurczliwych są w dużej mierze regulowane potranskrypcyjnie. Ponieważ wariacje w PC1 zostały wyjaśnione przede wszystkim za pomocą terminologii ontologii genów rybosomalnych, a rybosomy odgrywają kluczową i wyspecjalizowaną rolę w komórce, aktywnie uczestnicząc w translacji białek i wpływając na nią,31 postanowiliśmy zbadać tę nieoczekiwaną heterogeniczność rybosomów.
Najpierw pokolorowaliśmy wykres analizy głównych składowych proteomiki zgodnie ze względną obfitością białek w terminie GOCC „rybosom cytoplazmatyczny” (Rysunek 3A). Chociaż termin ten jest wzbogacony po stronie dodatniej PC1, co skutkuje niewielkim gradientem, białka rybosomalne napędzają partycjonowanie PC1 w obu kierunkach (Rysunek 3A). Białka rybosomalne wzbogacone po stronie ujemnej PC1 obejmowały RPL18, RPS18 i RPS13 (Rysunek 3B), podczas gdy RPL31, RPL35 i RPL38 (Rysunek 3C) były głównymi czynnikami napędzającymi po stronie dodatniej PC1. Co ciekawe, RPL38 i RPS13 były silnie ekspresjonowane w mięśniach szkieletowych w porównaniu z innymi tkankami (Rysunek uzupełniający 7A). Te charakterystyczne sygnatury rybosomalne w PC1 nie były obserwowane w transkryptomie (Rysunek uzupełniający 7B), co wskazuje na regulację potranskrypcyjną.
A. Wykres analizy głównych składowych (PCA) pokolorowany zgodnie z terminologią ontologii genu rybosomalnego cytoplazmy (GO) w całym proteomie. Strzałki wskazują kierunek zmienności zależnej od białek na wykresie PCA. Długość linii odpowiada punktacji głównych składowych dla danego białka. B, C. Wykresy cech PCA dla RPS13 i RPL38. D. Nienadzorowana analiza klasterów hierarchicznych białek rybosomalnych cytoplazmy. E. Model strukturalny rybosomu 80S (PDB: 4V6X) z wyróżnieniem białek rybosomalnych o różnym udziale we włóknach mięśni szkieletowych. F. Białka rybosomalne o różnej stechiometrii zlokalizowane w pobliżu kanału wyjścia mRNA.
Koncepcje heterogeniczności i specjalizacji rybosomów zostały już wcześniej zaproponowane. Zgodnie z nimi obecność odrębnych subpopulacji rybosomów (heterogenność rybosomalna) może bezpośrednio wpływać na translację białek w różnych tkankach32 i komórkach33 poprzez selektywną translację specyficznych pul transkryptów mRNA34 (specjalizacja rybosomów). Aby zidentyfikować subpopulacje białek rybosomalnych współekspresjonowanych we włóknach mięśni szkieletowych, przeprowadziliśmy nienadzorowaną analizę hierarchicznego klasteryzacji białek rybosomalnych w proteomie (Rysunek 3D, Zestaw Danych Uzupełniających 8). Zgodnie z oczekiwaniami, białka rybosomalne nie grupowały się według typu włókna na podstawie MYH. Zidentyfikowaliśmy jednak trzy odrębne klastry białek rybosomalnych; pierwszy klaster (ribosomal_cluster_1) jest współregulowany z RPL38 i dlatego wykazuje zwiększoną ekspresję we włóknach z dodatnim profilem PC1. Drugi klaster (ribosomal_cluster_2) jest współregulowany z RPS13 i jego poziom jest podwyższony we włóknach z ujemnym profilem PC1. Trzeci klaster (ribosomal_cluster_3) nie wykazuje skoordynowanej, zróżnicowanej ekspresji we włóknach mięśni szkieletowych i można go uznać za „rdzeniowe” białko rybosomalne mięśni szkieletowych. Zarówno klaster rybosomalny 1, jak i 2 zawierają białka rybosomalne, które, jak wykazano wcześniej, regulują translację alternatywną (np. RPL10A, RPL38, RPS19 i RPS25) i wpływają funkcjonalnie na rozwój (np. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Zgodnie z wynikami analizy PCA, obserwowana heterogeniczna reprezentacja tych białek rybosomalnych we włóknach również wykazała ciągłość (Rysunek uzupełniający 7C).
Aby zwizualizować lokalizację heterogenicznych białek rybosomalnych w rybosomie, wykorzystaliśmy model strukturalny ludzkiego rybosomu 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Rysunek 3E). Po wyizolowaniu białek rybosomalnych należących do różnych klastrów rybosomalnych, ich lokalizacje nie były ściśle powiązane, co sugeruje, że nasze podejście nie zapewniło wzbogacenia dla niektórych regionów/frakcji rybosomu. Co ciekawe, udział białek o dużych podjednostkach w klastrze 2 był niższy niż w klastrach 1 i 3 (Rysunek uzupełniający 7D). Zaobserwowaliśmy, że białka o zmienionej stechiometrii we włóknach mięśni szkieletowych były zlokalizowane głównie na powierzchni rybosomu (Rysunek 3E), co jest zgodne z ich zdolnością do interakcji z elementami wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES) w różnych populacjach mRNA, koordynując w ten sposób selektywną translację. 40, 41 Co więcej, wiele białek o zmienionej stechiometrii we włóknach mięśni szkieletowych zlokalizowanych jest w pobliżu obszarów funkcjonalnych, takich jak tunel wyjściowy mRNA (ryc. 3F), który selektywnie reguluje elongację translacji i zatrzymanie określonych peptydów. 42 Podsumowując, nasze dane sugerują, że stechiometria białek rybosomalnych mięśni szkieletowych wykazuje heterogeniczność, co skutkuje różnicami między włóknami mięśni szkieletowych.
Następnie zajęliśmy się identyfikacją sygnatur włókien szybko- i wolnokurczliwych oraz zbadaniem mechanizmów ich regulacji transkrypcyjnej. Porównując klastry włókien szybko- i wolnokurczliwych zdefiniowane przez UMAP w dwóch zestawach danych (rysunki 1G–H i 4A–B), analizy transkryptomiczne i proteomiczne zidentyfikowały odpowiednio 1366 i 804 różnicowo liczne cechy (rysunki 4A–B, zestawy danych uzupełniających 9–12). Zaobserwowaliśmy oczekiwane różnice w sygnaturach związanych z sarkomerami (np. tropomiozyna i troponina), sprzężeniem pobudzenie-skurcz (izoformy SERCA) oraz metabolizmem energetycznym (np. ALDOA i CKB). Ponadto, transkrypty i białka regulujące ubikwitynację białek były różnicowo ekspresjonowane we włóknach szybko- i wolnokurczliwych (np. USP54, SH3RF2, USP28 i USP48) (rysunki 4A–B). Co więcej, gen białka mikrobiologicznego RP11-451G4.2 (DWORF), który jak wykazano wcześniej, jest różnicowo ekspresjonowany w różnych typach włókien mięśniowych jagniąt43 i wzmacnia aktywność SERCA w mięśniu sercowym44, był istotnie podwyższony w wolnych włóknach mięśni szkieletowych (ryc. 4A). Podobnie, na poziomie poszczególnych włókien, zaobserwowano istotne różnice w znanych sygnaturach, takich jak izoformy dehydrogenazy mleczanowej związane z metabolizmem (LDHA i LDHB, ryc. 4C i ryc. uzupełniająca 8A)45,46, a także w nieznanych wcześniej sygnaturach specyficznych dla danego typu włókien (takich jak IRX3, USP54, USP28 i DPYSL3) (ryc. 4C). Stwierdzono istotne nakładanie się różnicowo ekspresjonowanych cech między zbiorami danych transkryptomowych i proteomicznych (ryc. uzupełniająca 8B), a także korelację krotności zmiany, napędzaną głównie przez wyraźniejszą różnicową ekspresję cech sarkomerów (ryc. uzupełniająca 8C). Co godne uwagi, niektóre sygnatury (np. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) wykazały silną regulację potranskrypcyjną tylko na poziomie proteomicznym i miały profile ekspresji specyficzne dla typu włókien kurczliwych wolno/szybko (Rysunek uzupełniający 8C).
Wykresy wulkaniczne A i B porównujące wolne i szybkie klastry zidentyfikowane przez wykresy przybliżenia i projekcji rozmaitości jednorodnej (UMAP) na rysunkach 1G–H. Kolorowe kropki reprezentują transkrypty lub białka, które różnią się istotnie przy FDR < 0,05, a ciemniejsze kropki reprezentują transkrypty lub białka, które różnią się istotnie przy logarytmicznej zmianie > 1. Dwukierunkową analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu Walda DESeq2 z wartościami p skorygowanymi metodą Benjaminiego–Hochberga (transkryptomika) lub metody liniowego modelu Limma z empiryczną analizą bayesowską, a następnie korektą Benjaminiego–Hochberga dla wielokrotnych porównań (proteomika). C Wykresy sygnatur wybranych różnicowo ekspresjonowanych genów lub białek pomiędzy włóknami wolnymi i szybkimi. D Analiza wzbogacenia istotnie różnicowo ekspresjonowanych transkryptów i białek. Nakładające się wartości są wzbogacane w obu zestawach danych, wartości transkryptomu są wzbogacane tylko w transkryptomie, a wartości proteomu są wzbogacane tylko w proteomie. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu pakietu clusterProfiler z wartościami p skorygowanymi metodą Benjaminiego-Hochberga. E. Czynniki transkrypcyjne specyficzne dla typu włókien zidentyfikowane przez SCENIC na podstawie wyników specyficzności regulatorów uzyskanych przez SCENIC oraz różnic w ekspresji mRNA między typami włókien. F. Profilowanie wybranych czynników transkrypcyjnych różnicujących ekspresję między włóknami wolnymi i szybkimi.
Następnie przeprowadziliśmy analizę nadreprezentacji różnicowo reprezentowanych genów i białek (Rysunek 4D, Zestaw Danych Uzupełniających 13). Wzbogacenie szlaków o cechy różniące się między dwoma zestawami danych ujawniło oczekiwane różnice, takie jak procesy β-oksydacji kwasów tłuszczowych i metabolizmu ketonów (włókna wolne), skurcz mięśni/włókna mięśniowego (odpowiednio włókna szybkie i wolne) oraz procesy kataboliczne węglowodanów (włókna szybkie). Aktywność fosfatazy serynowo-treoninowej była również podwyższona we włóknach szybkich, co wynikało z takich cech, jak podjednostki fosfatazy regulacyjnej i katalitycznej (PPP3CB, PPP1R3D i PPP1R3A), o których wiadomo, że regulują metabolizm glikogenu (47) (Rysunki Uzupełniające 8D–E). Inne szlaki bogate w szybkie włókna obejmowały ciała przetwarzające (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) w proteomie (Rys. uzupełniający 8F), potencjalnie zaangażowane w regulację potranskrypcyjną (48), oraz aktywność czynników transkrypcyjnych (SREBF1, RXRG, RORA) w transkryptomie (Rys. uzupełniający 8G). Włókna wolne charakteryzowały się zwiększoną aktywnością oksydoreduktazy (BDH1, DCXR, TXN2) (Rys. uzupełniający 8H), wiązaniem amidów (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Rys. uzupełniający 8I), macierzą zewnątrzkomórkową (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Rys. uzupełniający 8J) oraz aktywnością receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Rys. uzupełniający 8K).
Aby uzyskać lepszy wgląd w regulację transkrypcyjną leżącą u podstaw cech typu włókien mięśniowych wolnych/szybkich, przeprowadziliśmy analizę wzbogacenia czynników transkrypcyjnych przy użyciu SCENIC49 (Zestaw danych uzupełniających 14). Wiele czynników transkrypcyjnych było istotnie wzbogaconych pomiędzy szybkimi i wolnymi włóknami mięśniowymi (Rysunek 4E). Obejmowało to czynniki transkrypcyjne, takie jak MAFA, który wcześniej został powiązany z rozwojem szybkich włókien mięśniowych,50 jak również kilka czynników transkrypcyjnych, które wcześniej nie były powiązane z programami genów specyficznych dla typu włókien mięśniowych. Spośród nich, PITX1, EGR1 i MYF6 były najbardziej wzbogaconymi czynnikami transkrypcyjnymi we włóknach mięśniowych szybkich (Rysunek 4E). Natomiast ZSCAN30 i EPAS1 (znany również jako HIF2A) były najbardziej wzbogaconymi czynnikami transkrypcyjnymi we włóknach mięśniowych wolnych (Rysunek 4E). Zgodnie z tym, MAFA był wyrażany na wyższych poziomach w regionie UMAP odpowiadającym szybkim włóknom mięśniowym, podczas gdy EPAS1 miał przeciwny wzór ekspresji (Rysunek 4F).
Oprócz znanych genów kodujących białka istnieje wiele biotypów niekodującego RNA, które mogą brać udział w regulacji rozwoju i chorób u ludzi. 51, 52 W zestawach danych transkryptomu kilka niekodujących RNA wykazuje specyficzność typu włókien (ryc. 5A i zestaw danych uzupełniających 15), w tym LINC01405, który jest wysoce specyficzny dla włókien powolnych i którego zmniejszone stężenie w mięśniach pacjentów z miopatią mitochondrialną jest zgłaszane. 53 Z kolei RP11-255P5.3, odpowiadający genowi lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, wykazuje specyficzność typu włókien szybkich. Zarówno LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), jak i RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) wykazują specyficzność dla mięśni szkieletowych (rysunki uzupełniające 9A–B) i nie mają znanych genów kurczliwości w swoim 1-megabitowym sąsiedztwie genomowym, co sugeruje, że odgrywają one wyspecjalizowaną rolę w regulacji typów włókien, a nie w regulacji sąsiednich genów kurczliwości. Profile ekspresji specyficznych dla typów włókien, odpowiednio dla LINC01405 i RP11-255P5.3, odpowiednio, o wolnej/szybkiej ekspresji, zostały potwierdzone za pomocą RNAscope (rysunki 5B–C).
A. Transkrypty niekodującego RNA są znacząco regulowane we włóknach mięśniowych wolno- i szybkokurczliwych. B. Reprezentatywne obrazy RNAscope przedstawiające specyficzność LINC01405 i RP11-255P5.3 dla włókien wolno- i szybkokurczliwych. Skala = 50 μm. C. Kwantyfikacja ekspresji niekodującego RNA specyficznego dla typu włókien mięśniowych, określona za pomocą RNAscope (n = 3 biopsje od niezależnych osób, porównujące włókna mięśniowe szybko- i wolnokurczliwe u każdej osoby). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. Wykresy pudełkowe przedstawiają medianę oraz pierwszy i trzeci kwartyl, z wąsami wskazującymi wartości minimalne i maksymalne. D. Schemat identyfikacji białek bakteryjnych de novo (utworzony za pomocą BioRender.com). E. Białko mikrobiologiczne LINC01405_ORF408:17441:17358 jest specyficznie ekspresjonowane w wolnych włóknach mięśni szkieletowych (n = 5 biopsji od niezależnych uczestników, porównujących szybkie i wolne włókna mięśniowe u każdego uczestnika). Analizę statystyczną przeprowadzono z użyciem liniowej metody Limma w połączeniu z empirycznym podejściem bayesowskim, a następnie metodą Benjaminiego-Hochberga do wielokrotnych porównań z korektą wartości p. Wykresy pudełkowe przedstawiają medianę, pierwszy i trzeci kwartyl, z wąsami wskazującymi wartości maksymalne/minimalne.
Ostatnio badania wykazały, że wiele domniemanych niekodujących transkryptów koduje transkrybowane białka bakteryjne, z których niektóre regulują funkcję mięśni. 44, 55 Aby zidentyfikować białka bakteryjne o potencjalnej specyficzności typu włókien, przeszukaliśmy nasz zbiór danych proteomu 1000 włókien, używając niestandardowego pliku FASTA zawierającego sekwencje niekodujących transkryptów (n = 305) znalezionych w zbiorze danych transkryptomu 1000 włókien (Rysunek 5D). Zidentyfikowaliśmy 197 białek bakteryjnych z 22 różnych transkryptów, z których 71 było różnicowo regulowanych między wolnymi i szybkimi włóknami mięśni szkieletowych (Rysunek uzupełniający 9C i Zestaw danych uzupełniających 16). Dla LINC01405 zidentyfikowano trzy produkty białkowe bakteryjne, z których jeden wykazywał podobną specyficzność włókien wolnych do swojego transkryptu (Rysunek 5E i Rysunek uzupełniający 9D). Zatem zidentyfikowaliśmy LINC01405 jako gen kodujący białko bakteryjne specyficzne dla wolnych włókien mięśni szkieletowych.
Opracowaliśmy kompleksowy schemat postępowania do wielkoskalowej charakterystyki proteomicznej poszczególnych włókien mięśniowych i zidentyfikowaliśmy regulatory heterogeniczności włókien w stanie zdrowia. Zastosowaliśmy ten schemat postępowania, aby zrozumieć, jak miopatie nemalinowe wpływają na heterogeniczność włókien mięśni szkieletowych. Miopatie nemalinowe to dziedziczne choroby mięśni, które powodują osłabienie mięśni i u dotkniętych nimi dzieci objawiają się szeregiem powikłań, w tym niewydolnością oddechową, skoliozą i ograniczeniem ruchomości kończyn. 19,20 Zazwyczaj w miopatiach nemalinowych patogenne warianty w genach, takich jak aktyna alfa 1 (ACTA1), powodują przewagę składu włókien mięśniowych o powolnym skurczu, chociaż efekt ten jest heterogeniczny. Jednym godnym uwagi wyjątkiem jest miopatia nemalinowa T1 (TNNT1), w której przeważają włókna szybkokurczliwe. Zatem lepsze zrozumienie heterogeniczności leżącej u podstaw dysregulacji włókien mięśni szkieletowych obserwowanej w miopatiach nemalinowych może pomóc w wyjaśnieniu złożonej zależności pomiędzy tymi chorobami a typem włókien mięśniowych.
W porównaniu ze zdrowymi osobami kontrolnymi (n=3 w grupie), włókna mięśniowe wyizolowane od pacjentów z miopatią nemalinową, u których występowały mutacje w genach ACTA1 i TNNT1, wykazywały wyraźny zanik lub dystrofię włókien mięśniowych (rycina 6A, tabela uzupełniająca 3). Stwarzało to znaczne trudności techniczne dla analizy proteomicznej ze względu na ograniczoną ilość dostępnego materiału. Mimo to, udało nam się wykryć 2485 białek w 272 włóknach mięśniowych szkieletu. Po przefiltrowaniu pod kątem co najmniej 1000 skwantyfikowanych białek na włókno, 250 włókien poddano dalszej analizie bioinformatycznej. Po przefiltrowaniu, średnio skwantyfikowano 1573 ± 359 białek na włókno (rycina uzupełniająca 10A, zestawy danych uzupełniających 17–18). Co istotne, pomimo znacznego zmniejszenia rozmiaru włókien, głębokość proteomu próbek pacjentów z miopatią nemalinową uległa jedynie nieznacznemu zmniejszeniu. Co więcej, przetwarzanie tych danych z wykorzystaniem naszych własnych plików FASTA (w tym transkryptów niekodujących) pozwoliło nam zidentyfikować pięć białek drobnoustrojów w mięśniach szkieletowych pacjentów z miopatią nemalinową (Zestaw Danych Uzupełniających 19). Zakres dynamiczny proteomu był istotnie szerszy, a całkowita zawartość białek w grupie kontrolnej dobrze korelowała z wynikami wcześniejszej analizy proteomu 1000 włókien (Rys. Uzupełniające 10B–C).
A. Obrazy mikroskopowe ukazujące zanik lub dystrofię włókien mięśniowych oraz przewagę różnych typów włókien na podstawie MYH w miopatiach nemalinowych ACTA1 i TNNT1 (NM). Skala = 100 μm. Aby zapewnić powtarzalność barwienia u pacjentów z ACTA1 i TNNT1, trzy biopsje pacjentów barwiono 2-3 razy (cztery skrawki na przypadek) przed wyborem reprezentatywnych obrazów. B. Proporcje typów włókien u uczestników na podstawie MYH. C. Wykres analizy głównych składowych (PCA) włókien mięśni szkieletowych u pacjentów z miopatiami nemalinowymi i w grupie kontrolnej. D. Włókna mięśni szkieletowych od pacjentów z miopatiami nemalinowymi i kontroli rzutowane na wykres PCA określony na podstawie 1000 włókien analizowanych na Rysunku 2. Na przykład wykresy wulkaniczne porównujące różnice między uczestnikami z miopatiami nemalinowymi ACTA1 i TNNT1 a kontrolami oraz między uczestnikami z miopatiami nemalinowymi ACTA1 i TNNT1. Kolorowe kółka oznaczają białka, które były istotnie różne przy π < 0,05, a ciemne kropki oznaczają białka, które były istotnie różne przy FDR < 0,05. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu metody liniowego modelu Limma i empirycznych metod bayesowskich, a następnie skorygowano wartość p dla wielokrotnych porównań przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga. H. Analiza wzbogacenia białek istotnie różnicowo ekspresjonowanych w całym proteomie oraz we włóknach typu 1 i 2A. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu pakietu clusterProfiler i skorygowanych wartości p Benjaminiego-Hochberga. I, J. Wykresy analizy głównych składowych (PCA) pokolorowane według terminów macierzy zewnątrzkomórkowej i ontologii genów mitochondrialnych (GO).
Ponieważ miopatie nemalinowe mogą wpływać na proporcję typów miofibryli z ekspresją MYH w mięśniach szkieletowych,19,20 najpierw zbadaliśmy typy miofibryli z ekspresją MYH u pacjentów z miopatiami nemalinowymi i u osób z grupy kontrolnej. Określiliśmy typ miofibryli za pomocą obiektywnej metody opisanej wcześniej dla testu 1000 miofibryli (rysunki uzupełniające 10D–E) i ponownie nie udało nam się zidentyfikować czystych miofibryli 2X (ryc. 6B). Zaobserwowaliśmy heterogeniczny wpływ miopatii nemalinowych na typ miofibryli, ponieważ u dwóch pacjentów z mutacjami ACTA1 stwierdzono zwiększony odsetek miofibryli typu 1, podczas gdy u dwóch pacjentów z miopatią nemalinową TNNT1 odsetek miofibryli typu 1 był zmniejszony (ryc. 6B). Rzeczywiście, ekspresja izoform MYH2 i szybkich troponin (TNNC2, TNNI2 i TNNT3) była zmniejszona w miopatiach ACTA1-nemalinowych, natomiast ekspresja MYH7 była zmniejszona w miopatiach TNNT1-nemalinowych (Rysunek uzupełniający 11A). Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o heterogenicznym przełączaniu typów włókien mięśniowych w miopatiach nemalinowych.19,20 Potwierdziliśmy te wyniki za pomocą immunohistochemii i stwierdziliśmy, że u pacjentów z miopatią ACTA1-nemalinową przeważały włókna mięśniowe typu 1, podczas gdy u pacjentów z miopatią TNNT1-nemalinową zaobserwowano odwrotny wzorzec (Rysunek 6A).
Na poziomie proteomu pojedynczego włókna, włókna mięśni szkieletowych od pacjentów z miopatią nemalinową ACTA1 i TNNT1 grupowały się z większością włókien kontrolnych, przy czym włókna z miopatią nemalinową TNNT1 były generalnie najciężej dotknięte (Rysunek 6C). Było to szczególnie widoczne podczas kreślenia wykresów analizy głównych składowych (PCA) włókien pseudo-rozszerzonych dla każdego pacjenta, przy czym pacjenci z miopatią nemalinową TNNT1 nr 2 i 3 wydawali się najbardziej odlegli od próbek kontrolnych (Rysunek uzupełniający 11B, Zestaw danych uzupełniających 20). Aby lepiej zrozumieć porównanie włókien od pacjentów z miopatią z włóknami zdrowymi, wykorzystaliśmy szczegółowe informacje uzyskane z analizy proteomicznej 1000 włókien od zdrowych dorosłych uczestników. Włókna z zestawu danych miopatii (pacjenci z miopatią nemalinową ACTA1 i TNNT1 oraz grupa kontrolna) na wykres PCA uzyskany z analizy proteomicznej 1000 włókien (Rysunek 6D). Rozkład typów włókien MYH wzdłuż PC2 we włóknach kontrolnych był podobny do rozkładu włókien uzyskanego z analizy proteomicznej 1000 włókien. Jednak większość włókien u pacjentów z miopatią nemalinową przesunęła się w dół PC2, nakładając się na zdrowe włókna szybkokurczliwe, niezależnie od ich natywnego typu włókien MYH. Zatem, chociaż pacjenci z miopatią nemalinową ACTA1 wykazali przesunięcie w kierunku włókien typu 1 po ilościowej ocenie metodami opartymi na MYH, zarówno miopatia nemalinowa ACTA1, jak i miopatia nemalinowa TNNT1 przesunęły proteom włókien mięśni szkieletowych w kierunku włókien szybkokurczliwych.
Następnie bezpośrednio porównaliśmy każdą grupę pacjentów ze zdrowymi osobami kontrolnymi i zidentyfikowaliśmy odpowiednio 256 i 552 białka o zróżnicowanej ekspresji w miopatiach nemalinowych ACTA1 i TNNT1 (rycina 6E–G i rycina uzupełniająca 11C, zestaw danych uzupełniających 21). Analiza wzbogacania genów wykazała skoordynowany spadek białek mitochondrialnych (rycina 6H–I, zestaw danych uzupełniających 22). Co zaskakujące, pomimo zróżnicowanej przewagi typów włókien w miopatiach nemalinowych ACTA1 i TNNT1, spadek ten był całkowicie niezależny od typu włókien opartego na MYH (rycina 6H i ryciny uzupełniające 11D–I, zestaw danych uzupełniających 23). W miopatiach nemalinowych ACTA1 i TNNT1 regulowano również trzy białka bakteryjne. Dwa z tych mikroprotein, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (znane również jako LINC00598 lub Lnc-FOXO1) i ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), wykazały różnicową liczebność tylko w miofibrylach typu 1. Wcześniej donoszono, że ENSG00000215483_TR14_ORF67 odgrywa rolę w regulacji cyklu komórkowego. 56 Z drugiej strony, stężenie ENSG00000232046_TR1_ORF437 (odpowiadającego LINC01798) wzrosło zarówno w miofibrylach typu 1, jak i typu 2A w miopatii ACTA1-nemalinowej w porównaniu ze zdrowymi osobami kontrolnymi (Rysunek uzupełniający 12A, Zestaw danych uzupełniających 24). W przeciwieństwie do tego białka rybosomalne nie były w dużym stopniu dotknięte miopatią nemalinową, chociaż ekspresja RPS17 była zmniejszona w miopatii nemalinowej ACTA1 (ryc. 6E).
Analiza wzbogacenia wykazała również wzmożoną ekspresję procesów układu odpornościowego w miopatiach nemalinowych ACTA1 i TNNT1, podczas gdy adhezja komórkowa była również zwiększona w miopatii nemalinowej TNNT1 (rycina 6H). Wzbogacenie tych czynników zewnątrzkomórkowych znalazło odzwierciedlenie w białkach macierzy zewnątrzkomórkowej, które przesunęły PCA w PC1 i PC2 w kierunku ujemnym (tj. w kierunku włókien najbardziej dotkniętych chorobą) (rycina 6J). Obie grupy pacjentów wykazały zwiększoną ekspresję białek zewnątrzkomórkowych zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne i mechanizmy naprawy sarkolemy, takich jak aneksyny (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 i oddziałujące z nimi białko S100A1159 (ryciny uzupełniające 12B–C). Wcześniej opisywano nasilenie tego procesu w dystrofiach mięśniowych60, ale według naszej wiedzy nie był on wcześniej powiązany z miopatiami nemalinowymi. Prawidłowe funkcjonowanie tej maszynerii molekularnej jest niezbędne do naprawy sarkolemy po urazie oraz do fuzji nowo powstałych miocytów z włóknami mięśniowymi58,61. Zatem zwiększona aktywność tego procesu w obu grupach pacjentów sugeruje reakcję naprawczą na uszkodzenie spowodowane niestabilnością włókien mięśniowych.
Efekty każdej miopatii nemalinowej były dobrze skorelowane (r = 0,736) i wykazywały rozsądne nakładanie się (rysunki uzupełniające 11A–B), co wskazuje, że miopatie nemalinowe ACTA1 i TNNT1 mają podobny wpływ na proteom. Jednak niektóre białka były regulowane tylko w miopatii nemalinowej ACTA1 lub TNNT1 (rysunki uzupełniające 11A i C). Profibrotyczne białko MFAP4 było jednym z białek o największej ekspresji w miopatii nemalinowej TNNT1, ale pozostało niezmienione w miopatii nemalinowej ACTA1. SKIC8, składnik kompleksu PAF1C odpowiedzialny za regulację transkrypcji genu HOX, był zmniejszony w miopatii nemalinowej TNNT1, ale nie został naruszony w miopatii nemalinowej ACTA1 (rysunek uzupełniający 11A). Bezpośrednie porównanie miopatii nemalinowej ACTA1 i TNNT1 wykazało większe zmniejszenie stężenia białek mitochondrialnych i wzrost stężenia białek układu odpornościowego w miopatii nemalinowej TNNT1 (rycina 6G–H oraz ryciny uzupełniające 11C i 11H–I). Dane te są zgodne z większym zanikiem/dystrofią obserwowaną w miopatii nemalinowej TNNT1 w porównaniu z miopatią nemalinową TNNT1 (rycina 6A), co sugeruje, że miopatia nemalinowa TNNT1 stanowi cięższą postać choroby.
Aby ocenić, czy obserwowane skutki miopatii nemalinowej utrzymują się na poziomie całego mięśnia, przeprowadziliśmy zbiorczą analizę proteomiczną biopsji mięśni pochodzących z tej samej kohorty pacjentów z miopatią nemalinową TNNT1 i porównaliśmy je z grupą kontrolną (n = 3 w każdej grupie) (Rysunek uzupełniający 13A, Zestaw danych uzupełniających 25). Zgodnie z oczekiwaniami, grupa kontrolna była blisko spokrewniona w analizie głównych składowych, natomiast pacjenci z miopatią nemalinową TNNT1 wykazali wyższą zmienność międzypróbkową, podobną do obserwowanej w analizie pojedynczych włókien (Rysunek uzupełniający 13B). Analiza zbiorcza odtworzyła różnicowo ekspresjonowane białka (Rysunek uzupełniający 13C, Zestaw danych uzupełniających 26) i procesy biologiczne (Rysunek uzupełniający 13D, Zestaw danych uzupełniających 27), uwydatnione przez porównanie poszczególnych włókien, ale utraciła zdolność rozróżniania różnych typów włókien i nie uwzględniła heterogenicznych skutków chorobowych w różnych włóknach.
Łącznie, dane te dowodzą, że proteomika pojedynczych włókien mięśniowych może wyjaśnić kliniczne cechy biologiczne, które nie są wykrywalne metodami celowanymi, takimi jak immunoblotting. Co więcej, dane te uwypuklają ograniczenia stosowania wyłącznie typizacji włókien aktynowych (MYH) do opisu adaptacji fenotypowej. W istocie, chociaż przełączanie typów włókien różni się w miopatiach nemalinowych aktynowych i troponinowych, obie miopatie nemalinowe oddzielają typizację włókien MYH od metabolizmu włókien mięśni szkieletowych, prowadząc do szybszego i mniej oksydacyjnego proteomu mięśni.
Heterogeniczność komórkowa ma kluczowe znaczenie dla tkanek, aby mogły sprostać zróżnicowanym potrzebom. W mięśniach szkieletowych jest to często opisywane jako typy włókien charakteryzujące się różnym stopniem wytwarzania siły i podatnością na zmęczenie. Jest jednak oczywiste, że wyjaśnia to tylko niewielką część zmienności włókien mięśni szkieletowych, która jest znacznie bardziej zmienna, złożona i wielopłaszczyznowa niż wcześniej sądzono. Postęp technologiczny rzucił światło na czynniki regulujące włókna mięśni szkieletowych. Rzeczywiście, nasze dane sugerują, że włókna typu 2X mogą nie być odrębnym podtypem włókien mięśni szkieletowych. Ponadto zidentyfikowaliśmy białka metaboliczne, białka rybosomalne i białka związane z komórkami jako główne determinanty heterogeniczności włókien mięśni szkieletowych. Stosując nasz schemat pracy proteomicznej do próbek pacjentów z miopatią nicieniową, wykazaliśmy ponadto, że typowanie włókien oparte na MYH nie odzwierciedla w pełni heterogeniczności mięśni szkieletowych, zwłaszcza w przypadku zaburzeń układu. Rzeczywiście, niezależnie od rodzaju włókien opartych na MYH, miopatia nicieniowa skutkuje przesunięciem w stronę szybszych i mniej utleniających włókien.
Włókna mięśni szkieletowych są klasyfikowane od XIX wieku. Najnowsze analizy omikowe pozwoliły nam zrozumieć profile ekspresji różnych typów włókien MYH i ich reakcje na różne bodźce. Jak opisano w niniejszym artykule, podejścia omikowe mają również tę zaletę, że zapewniają większą czułość w ilościowym oznaczaniu markerów typów włókien niż tradycyjne metody oparte na przeciwciałach, bez konieczności polegania na ilościowym oznaczaniu pojedynczego (lub kilku) markerów w celu zdefiniowania typu włókna mięśni szkieletowych. Wykorzystaliśmy uzupełniające się procesy transkryptomiczne i proteomiczne oraz zintegrowaliśmy wyniki, aby zbadać transkrypcyjną i potranskrypcyjną regulację heterogeniczności włókien ludzkich mięśni szkieletowych. Ten proces pracy doprowadził do niepowodzenia w identyfikacji czystych włókien typu 2X na poziomie białka w mięśniu obszernym bocznym naszej kohorty zdrowych młodych mężczyzn. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami pojedynczych włókien, w których stwierdzono <1% czystych włókien 2X w zdrowym mięśniu obszernym bocznym, chociaż powinno to zostać potwierdzone w innych mięśniach w przyszłości. Rozbieżność między wykryciem niemal czystych włókien 2X na poziomie mRNA a jedynie mieszanych włókien 2A/2X na poziomie białka jest zagadkowa. Ekspresja mRNA izoformy MYH nie jest dobowa,67 co sugeruje, że jest mało prawdopodobne, abyśmy „przeoczyli” sygnał rozpoczęcia MYH2 w pozornie czystych włóknach 2X na poziomie RNA. Jednym z możliwych wyjaśnień, choć czysto hipotetycznych, mogą być różnice w stabilności białka i/lub mRNA między izoformami MYH. W rzeczywistości żadne szybkie włókno nie jest w 100% czyste dla żadnej izoformy MYH i nie jest jasne, czy poziomy ekspresji mRNA MYH1 w zakresie 70–90% skutkowałyby równą obfitością MYH1 i MYH2 na poziomie białka. Jednakże, biorąc pod uwagę cały transkryptom lub proteom, analiza skupień może z pewnością zidentyfikować tylko dwa odrębne skupiska reprezentujące wolne i szybkie włókna mięśni szkieletowych, niezależnie od ich dokładnego składu MYH. Jest to zgodne z analizami wykorzystującymi podejścia transkryptomiczne pojedynczego jądra, które zazwyczaj identyfikują tylko dwa odrębne skupiska jąder mięśniowych. 68, 69, 70 Co więcej, chociaż wcześniejsze badania proteomiczne zidentyfikowały włókna typu 2X, włókna te nie grupują się oddzielnie od reszty szybkich włókien i wykazują jedynie niewielką liczbę białek o zróżnicowanej obfitości w porównaniu z innymi typami włókien opartymi na MYH. 14 Wyniki te sugerują, że powinniśmy powrócić do poglądu na klasyfikację włókien mięśniowych z początku XX wieku, który dzielił ludzkie włókna mięśni szkieletowych nie na trzy odrębne klasy na podstawie MYH, lecz na dwa skupiska na podstawie ich właściwości metabolicznych i kurczliwych. 63
Co ważniejsze, heterogeniczność włókien mięśniowych należy rozpatrywać w wielu wymiarach. Wcześniejsze badania „omiczne” wskazywały na ten kierunek, sugerując, że włókna mięśni szkieletowych nie tworzą odrębnych skupisk, lecz są ułożone w sposób ciągły. 11, 13, 14, 64, 71 W niniejszym artykule pokazujemy, że oprócz różnic we właściwościach kurczliwych i metabolicznych mięśni szkieletowych, włókna mięśniowe można różnicować na podstawie cech związanych z interakcjami międzykomórkowymi i mechanizmami translacji. Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy heterogeniczność rybosomów we włóknach mięśni szkieletowych, która przyczynia się do heterogeniczności niezależnie od typu włókien wolnych i szybkich. Przyczyna tej znacznej heterogeniczności włókien mięśniowych, niezależnie od typu włókien wolnych i szybkich, pozostaje niejasna, ale może wskazywać na wyspecjalizowaną organizację przestrzenną w obrębie wiązek mięśniowych, które optymalnie reagują na określone siły i obciążenia,72 wyspecjalizowaną komunikację komórkową lub narządowo-specyficzną z innymi typami komórek w mikrośrodowisku mięśniowym73,74,75 lub różnice w aktywności rybosomów w obrębie poszczególnych włókien mięśniowych. W istocie, wykazano, że heteroplazmia rybosomalna, czy to poprzez paralogiczną substytucję RPL3 i RPL3L, czy na poziomie 2′O-metylacji rRNA, jest związana z hipertrofią mięśni szkieletowych76,77. Zastosowania multiomiczne i przestrzenne w połączeniu z funkcjonalną charakterystyką poszczególnych włókien mięśniowych pogłębią naszą wiedzę na temat biologii mięśni na poziomie multiomicznym78.
Analizując proteomy pojedynczych włókien mięśniowych u pacjentów z miopatiami nemalinowymi, wykazaliśmy również użyteczność, skuteczność i przydatność proteomiki pojedynczych włókien mięśniowych do wyjaśnienia patofizjologii klinicznej mięśni szkieletowych. Co więcej, porównując nasz proces z globalną analizą proteomiczną, byliśmy w stanie wykazać, że proteomika pojedynczych włókien mięśniowych dostarcza takiej samej głębi informacji, jak globalna proteomika tkanek, a dodatkowo poszerza tę głębię, uwzględniając heterogeniczność międzywłókien i typ włókien mięśniowych. Oprócz oczekiwanych (choć zmiennych) różnic w stosunku typów włókien obserwowanych w miopatiach nemalinowych ACTA1 i TNNT1 w porównaniu ze zdrowymi osobami kontrolnymi19, zaobserwowaliśmy również przebudowę oksydacyjną i zewnątrzkomórkową niezależną od zmiany typu włókien pod wpływem MYH. Włóknienie zgłaszano już wcześniej w przypadku miopatii nemalinowych TNNT1.19 Jednak nasza analiza opiera się na tym odkryciu, ujawniając również zwiększone poziomy wydzielanych pozakomórkowo białek związanych ze stresem, takich jak aneksyny, biorące udział w mechanizmach naprawy sarkolemy, we włóknach mięśniowych pacjentów z miopatiami nemalinowymi ACTA1 i TNNT1.57,58,59 Podsumowując, zwiększone poziomy aneksyny we włóknach mięśniowych pacjentów z miopatią nemalinową mogą stanowić odpowiedź komórkową mającą na celu naprawę silnie zanikowych włókien mięśniowych.
Chociaż niniejsze badanie stanowi największą jak dotąd analizę pojedynczych włókien mięśniowych u ludzi, nie jest ono pozbawione ograniczeń. Wyizolowaliśmy włókna mięśni szkieletowych ze stosunkowo małej i jednorodnej próby uczestników oraz pojedynczego mięśnia (mięśnia obszernego bocznego). W związku z tym nie można wykluczyć istnienia specyficznych populacji włókien w różnych typach mięśni i na skrajnych poziomach fizjologii mięśni. Na przykład, nie możemy wykluczyć możliwości pojawienia się podzbioru ultraszybkich włókien (np. czystych włókien 2X) u wysoko wytrenowanych sprinterów i/lub sportowców siłowych79 lub w okresach bezczynności mięśniowej66,80. Co więcej, ograniczona liczebność próby uczestników uniemożliwiła nam zbadanie różnic płciowych w heterogeniczności włókien, ponieważ wiadomo, że proporcje typów włókien różnią się między mężczyznami i kobietami. Co więcej, nie byliśmy w stanie przeprowadzić analiz transkryptomicznych i proteomicznych na tych samych włóknach mięśniowych ani próbkach od tych samych uczestników. W miarę jak my i inni kontynuujemy optymalizację analiz pojedynczych komórek i pojedynczych włókien mięśniowych przy użyciu analizy omicznej, aby osiągnąć niezwykle niskie wymagania dotyczące próbek (jak wykazano tutaj w analizie włókien pochodzących od pacjentów z miopatią mitochondrialną), staje się oczywista możliwość łączenia podejść multi-omicznych (i funkcjonalnych) w obrębie pojedynczych włókien mięśniowych.
Podsumowując, nasze dane identyfikują i wyjaśniają transkrypcyjne i potranskrypcyjne czynniki wpływające na heterogeniczność mięśni szkieletowych. W szczególności przedstawiamy dane, które podważają długoletni dogmat fizjologii mięśni szkieletowych, związany z klasyczną definicją typów włókien opartą na modelu MYH. Mamy nadzieję, że uda nam się wznowić debatę i ostatecznie zrewidować nasze rozumienie klasyfikacji i heterogeniczności włókien mięśni szkieletowych.
Czternastu uczestników rasy białej (12 mężczyzn i 2 kobiety) dobrowolnie wyraziło zgodę na udział w badaniu. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Uniwersyteckiego w Gandawie (BC-10237), było zgodne z Deklaracją Helsińską z 2013 roku i zostało zarejestrowane na stronie ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Ogólna charakterystyka uczestników została przedstawiona w Tabeli Uzupełniającej 1. Po uzyskaniu ustnej i pisemnej świadomej zgody, uczestnicy zostali poddani badaniu lekarskiemu przed ostatecznym włączeniem do badania. Uczestnicy byli młodzi (22–42 lata), zdrowi (bez schorzeń, bez historii palenia) i umiarkowanie aktywni fizycznie. Maksymalny pobór tlenu określono za pomocą ergometru stepowego w celu oceny sprawności fizycznej, jak opisano wcześniej. 81
Próbki biopsji mięśni pobrano w spoczynku i na czczo trzykrotnie, w odstępie 14 dni. Ponieważ próbki te pobrano w ramach większego badania, uczestnicy spożywali placebo (laktozę), antagonistę receptora H1 (540 mg feksofenadyny) lub antagonistę receptora H2 (40 mg famotydyny) 40 minut przed biopsją. Wcześniej wykazaliśmy, że ci antagoniści receptora histaminowego nie wpływają na sprawność mięśni szkieletowych w spoczynku81, a na naszych wykresach kontroli jakości nie zaobserwowano skupisk związanych ze stanem skupienia (rysunki uzupełniające 3 i 6). Standaryzowaną dietę (41,4 kcal/kg masy ciała, 5,1 g/kg masy ciała węglowodanów, 1,4 g/kg masy ciała białka i 1,6 g/kg masy ciała tłuszczu) stosowano przez 48 godzin przed każdym dniem eksperymentu, a standaryzowane śniadanie (1,5 g/kg masy ciała węglowodanów) spożywano rano w dniu eksperymentu. W znieczuleniu miejscowym (0,5 ml 1% lidokainy bez epinefryny) pobrano biopsje mięśnia obszernego bocznego metodą przezskórnej aspiracji Bergströma.82 Próbki mięśni natychmiast zatopiono w RNAlater i przechowywano w temperaturze 4°C do momentu ręcznej dysekcji włókien (do 3 dni).
Świeżo wyizolowane wiązki włókien mięśniowych przeniesiono do świeżego podłoża RNAlater w szalce hodowlanej. Następnie pojedyncze włókna mięśniowe ręcznie rozcięto za pomocą mikroskopu stereoskopowego i cienkiej pęsety. Z każdej biopsji wycięto dwadzieścia pięć włókien, zwracając szczególną uwagę na selekcję włókien z różnych obszarów biopsji. Po rozcięciu każde włókno delikatnie zanurzono w 3 μl buforu do lizy (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) zawierającego enzymy proteinazy K i DNazy w celu usunięcia niepożądanych białek i DNA. Liza komórek i usuwanie białek/DNA zostały następnie zainicjowane przez krótkie worteksowanie, odwirowanie cieczy w mikrowirówce i inkubację w temperaturze pokojowej (10 min). Lizat inkubowano następnie w termocyklerze (T100, Bio-Rad) w temperaturze 37°C przez 5 min, 75°C przez 5 min, a następnie natychmiast przechowywano w temperaturze -80°C do czasu dalszego przetwarzania.
Biblioteki poliadenylowanego RNA kompatybilne z systemem Illumina przygotowano z 2 µl lizatu włókien mięśniowych za pomocą zestawu QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Szczegółowe metody można znaleźć w instrukcji producenta. Proces rozpoczyna się od syntezy pierwszej nici cDNA metodą odwrotnej transkrypcji, podczas której wprowadzane są unikalne identyfikatory molekularne (UMI) i specyficzne dla próbki kody kreskowe I1, aby zapewnić łączenie próbek i zmniejszyć zmienność techniczną podczas dalszego przetwarzania. cDNA z 96 włókien mięśniowych jest następnie łączone i oczyszczane za pomocą kulek magnetycznych, po czym RNA jest usuwane, a synteza drugiej nici przeprowadzana jest z użyciem losowych starterów. Bibliotekę oczyszcza się za pomocą kulek magnetycznych, dodaje specyficzne dla puli znaczniki I5/I7, a następnie amplifikuje metodą PCR. Końcowy etap oczyszczania prowadzi do powstania bibliotek kompatybilnych z systemem Illumina. Jakość każdej puli bibliotek oceniano przy użyciu zestawu High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Na podstawie kwantyfikacji qubit, pule połączono w stężeniach równomolowych (2 nM). Powstałą pulę sekwencjonowano następnie na instrumencie NovaSeq 6000 w trybie standardowym, używając zestawu odczynników NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotydów) z obciążeniem 2 nM (4% PhiX).
Nasz potok danych oparty jest na potoku analizy danych QuantSeq Pool firmy Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Dane zostały najpierw zdemultipleksowane za pomocą bcl2fastq2 (v2.20.0) na podstawie indeksu i7/i5. Odczyt 2 został następnie zdemultipleksowany za pomocą idemux (v0.1.6) na podstawie kodu kreskowego próbki i1, a sekwencje UMI zostały wyekstrahowane za pomocą umi_tools (v1.0.1). Odczyty zostały następnie przycięte za pomocą cutadapt (v3.4) w wielu rundach w celu usunięcia krótkich odczytów (o długości poniżej 20) lub odczytów składających się wyłącznie z sekwencji adapterowych. Odczyty zostały następnie wyrównane z genomem ludzkim za pomocą STAR (v2.6.0c), a pliki BAM zostały zindeksowane za pomocą SAMtools (v1.11). Duplikaty odczytów usunięto za pomocą umi_tools (v1.0.1). Na koniec zliczanie wyrównań przeprowadzono za pomocą funkcji featureCounts w Subread (wersja 2.0.3). Kontrola jakości została przeprowadzona za pomocą FastQC (wersja 0.11.9) na kilku pośrednich etapach procesu.
Całe dalsze przetwarzanie i wizualizacja bioinformatyczna zostały przeprowadzone w środowisku R (wersja 4.2.3), głównie z wykorzystaniem przepływu pracy Seurat (wersja 4.4.0). 83 W związku z tym poszczególne wartości UMI i macierze metadanych zostały przekształcone w obiekty Seurat. Usunięto geny, których ekspresja wystąpiła w mniej niż 30% wszystkich włókien. Próbki niskiej jakości zostały usunięte na podstawie minimalnego progu 1000 wartości UMI i 1000 wykrytych genów. Ostatecznie 925 włókien przeszło wszystkie etapy filtrowania kontroli jakości. Wartości UMI zostały znormalizowane za pomocą metody Seurat SCTransform v2, 84 uwzględniając wszystkie 7418 wykrytych cech, a różnice między uczestnikami zostały poddane regresji. Wszystkie istotne metadane można znaleźć w Supplementary Dataset 28.
Czas publikacji: 10.09.2025